Webzine Sanità Pubblica Veterinaria
Numero 21 - settembre/ottobre 2003 - http://www.pg.izs.it/webzine.html
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Microscopia elettronica applicata allo studio dello
sperma bovino: Rolled head-giant crest syndrome
Manuali E., Sylla L., Eleni C., Gazzanelli G.
LAVORO PRESENTATO AL WORKSHOP:
La superficie cellulare: dalle molecole alla forma - Società Italiana di Microscopia Elettronica 
Dal 25 al 27 settembre 2003, presso il Campus Scientifico Universitario, si è svolto un workshop teorico-pratico dal titolo "La superficie cellulare: dalle molecole alla forma".
L'incontro è stato organizzato dalla neonata Società Italiana di Scienze Microscopiche (SISM), con l'obiettivo di aggiornare gli interessati sulle continue evoluzioni tecniche e scientifiche in ambito Biologico, Biomedico e in Scienza dei Materiali.
Il vasto programma ha anche previsto sessioni teorico-pratiche attraverso le quali è stato possibile approfondire la conoscenza di complesse e sempre più attuali strumentazioni quali ad esempio il microscopio confocale e a forza atomica. Alle dimostrazioni pratiche si sono alternate interessanti sessioni orali nelle quali i numerosi Relatori, a valenza Nazionale ed Internazionale, hanno fornito un contributo allo studio della superficie cellulare nell'apoptosi e nel rapporto cellula-farmaco, della diffusione metastatica e della neurogenesi.
La sessione posters ha permesso la discussione di numerosi lavori sia a carattere puramente scientifico che diagnostico: il nostro contributo è stato relativo allo studio dell'ipofertilità bovina attraverso metodiche di microscopia elettronica atte a valutare le caratteristiche ultrastrutturali degli spermatozoi ed in grado quindi di accrescere considerevolmente la quantità e la precisione delle informazioni derivanti dall'analisi del seme. |
INTRODUZIONE
L'esistenza di numerose anomalie morfologiche a carico dello spermatozoo bovino, spesso non evidenziabili con le metodiche analitiche convenzionali, rende necessaria un'analisi più approfondita attraverso l'indagine ultrastrutturale, in grado di accrescere considerevolmente la quantità e la precisione delle informazioni derivanti dall'analisi del seme.
In questo contesto la microscopia elettronica assume un ruolo di notevole importanza diagnostica, in grado di fornire un contributo allo studio della fertilità bovina.
Scopo del presente lavoro è valutare le caratteristiche ultrastrutturali degli spermatozoi di un torello di razza Marchigiana di 13 mesi, con l'obiettivo di descriverne le gravi anomalie della testa riscontrate.
MATERIALI E METODI
Sui campioni di seme, ottenuti con la tecnica della vagina artificiale, sono stati valutati il volume, la motilità progressiva, la concentrazione e la percentuale delle anomalie morfologiche previa colorazione con eosina nigrosina.
Un'aliquota di seme è stata inoltre sottoposta ad indagini per la microscopia elettronica. Gli spermatozoi sono stati fissati in glutaraldeide 0.1% in tampone fosfato 0.1 M pH 7.3 per 10 min. a 4°C e centrifugati a 3000 rpm per 5 min.
Dopo rimozione del surnatante, i pellets sono stati risospesi in glutaraldeide 0.1% in tampone fosfato 0.1 M per 45 min. a 4°C e ricentrifugati. I pellets così ottenuti sono stati sottoposti a lavaggi in PBS pH 7.2, postfissati in Osmio 1.3% in tampone fosfato 0.1 M per 1 ora a 4°C, disidratati, posti in ossido di propilene per 5 min. a t.a. ed inclusi in Epon 812. Sezioni ultrafini, colorate con acetato di uranile e piombo citrato, sono state esaminate a 80 KV utilizzando il microscopio elettronico CM 12 STEM (Philips).
Fig.1 Spermatozoi “giant headed”.
In sezione longitudinale, la curvatura della testa fa assumere
al nucleo un aspetto c.d. a forchetta (freccia). Bar 10 µm.
RISULTATI
All'esame clinico il soggetto era esente da anomalie morfologiche a carico dell'apparato genitale. Il volume medio dell'eiaculato era di 2ml con una concentrazione di 1.4 x 109spz/ml e motilità progressiva del 50%. Le alterazioni morfologiche erano rappresentate per il 69% da spermatozoi con gocce protoplasmatiche e per il 7.3% da anomalie della testa.
L'indagine ultrastrutturale evidenziava la presenza di spermatozoi caratterizzati da macrocefalia e provvisti di curvature e creste nucleari.
Tali alterazioni coinvolgevano almeno il 45 % dei nuclei ed in alcuni di essi era possibile riscontrare contemporaneamente le tre anomalie.
Le forme giganti (giant heads) erano caratterizzate dalla presenza di nuclei voluminosi, con cromatina spesso distribuita in modo irregolare o in aggregati.
Le cellule contraddistinte da nuclei curvati (rolled heads) mostravano un caratteristico aspetto a ferro di cavallo e/o a forchetta (Fig.1) assumendo un profilo variabile, condizionato dal grado di curvatura più o meno accentuato.
Era presente una membrana cellulare che circoscriveva il profilo nucleare avvolgendo quindi anche le creste (nuclear crests) evidenziabili, in sezioni trasversali, come proiezioni o braccia laterali dell'estremità nucleare.
All'interno della concavità formatasi in seguito alla curvatura del nucleo, vi era un accumulo di materiale membranoso spesso circoscritto da formazioni vescicolari (Fig.2).
Fig.2 Spermatozoo “roller headed”.
Presenza di materiale simil membranoso all'interno della curvatura nucleare.
Sono evidenti le due proiezioni laterali “crests” del nucleo (freccia). Bar 10 µm.
Erano occasionalmente presenti grosse cellule, aventi ampi residui citoplasmatici contenenti strutture lamellari, mitocondri, corpi multivescicolati, e nucleo di forma sferica localizzato in posizione centrale, parzialmente circoscritto da una membrana simil acrosomiale. (Fig.3).
Fig.3 Cellula spermatica
La cellula contiene un ampio residuo citoplasmatico,
caratterizzata dalla presenza di un grosso nucleo (N),
mitocondri (m) e corpi lamellari (CL). Bar 10 µm.
In corrispondenza delle gocce protoplasmatiche, evidenziate al microscopio ottico, erano presenti numerose vacuolazioni, più o meno elettrondense, interposte tra i mitocondri e la parete cellulare.
CONCLUSIONI
Le alterazioni morfologiche riscontrate attraverso l'indagine ultrastrutturale e non individuate con le tecniche routinarie di analisi del seme bovino, evidenziano il ruolo diagnostico della microscopia elettronica nello studio della fertilità bovina (1).
Nel presente lavoro sono state infatti analizzate e descritte le anomalie morfologiche non rilevate al microscopio ottico.
Tali anomalie sembrano essere associate alla "rolled head-giant crest syndrome” nella quale le alterazioni potrebbero avvenire allo stadio di spermatidi, con presenza di spermatozoi con corredo cromosomico diploide (2,3).
Si ipotizza un fattore genetico alla base della suddetta sindrome, sebbene non si possano escluderne altri quali lo stress o le malattie organiche. Saranno quindi necessarie ulteriori indagini al fine di valutare la capacità fertilizzante degli spermatozoi affetti dalle sopracitate anomalie morfologiche.
BIBLIOGRAFIA
1. Zamboni L. The ultrastructural pathology of the spermatozoon as a cause of infertilitythe role of electron microscopy in the evaluation of semen quality. Fert. and Sterility 1987. 48 (5) 711-732.
2. Barth A.D., Oko R.J. Abnormal morphology of bovine spermatozoa. Iowa State University Press, Ames IA, 1989. pp. 130266.
3. Kalahanis J., Rousso D., Kourtis A., Mavromatidis G., Makedos G., Par D. Round-headed spermatozoa in semen specimen from fertile subfertile men. J. Reprod. Med. 2002. Jun. 47(6) 489-93.
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RINGRAZIAMENTI
Si ringraziano: Matteo Sabbatini, Simona Checcarelli e Angela Caporali per il valido supporto tecnico fornito |
