Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 82, Febbraio 2014 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581

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Introduzione
Clostridium perfringens è un batterio anaerobio, Gram positivo, a forma bastoncellare presente come naturale componente del tratto intestinale dei mammiferi (Lebrun, 2010). Venne chiamato inizialmente Bacterium welchii e Clostridium welchii in onore di William Henry Welch, che fu il primo a descriverlo nel 1892. La specie prese, poi, il nome di Clostridium perfringens, proposto da Veillon e Zuber (1898), sostituendo welchii nella prima edizione di Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Bergey, 1939). I ceppi di C. perfringens sono tradizionalmente classificati in 5 tossinotipi (A,B,C, D e E) in base della produzione di 1 o più delle 4 maggiori tossine chiamate α (cpa), β (cpb), ε (etx) e ι (iap) (Uzal, 2011). Questi 5 tipi sono, inoltre, in grado di produrre ulteriori tossine minori tra cui: l'enterotossina (codificata dal gene cpe) e la tossina β-2 (codificata dal gene cpb2) (Lebrun, 2010). La presenza di tali tossine sembra aggravare le lesioni gastroenteriche negli animali. Nella tabella 1 sono riportati i tossinotipi e le relative tossine riscontrate nei bovini.



Nell'ambito della produzione primaria, le patologie legate ad infezioni da germi anaerobi sono frequenti e causa di rilevanti perdite economiche. Nel bovino e nei ruminanti in genere, prevalgono le enterotossiemie causate da Clostridium perfringens, seguito da Clostridium sordellii che rappresentano ancora oggi una malattia di notevole impatto negli allevamenti italiani.
In una ricerca precedente, effettuata presso il nostro Istituto, è stata dimostrata la presenza dei tossinotipi A, C e D nel territorio Umbro-Marchigiano, da campioni provenienti da diverse specie animali; in particolare il tipo A β-2 positivo è stato associato a casi di particolare gravità nei ruminanti, nei lagomorfi e nel suino (Forti, 2007). I trattamenti antibiotici non sono efficaci nel controllo delle tossinfezioni da C. perfringens nei ruminanti, vengono comunque utilizzati ampiamente per il controllo di infezioni concomitanti e questo sottopone tali agenti patogeni a una costante pressione selettiva. Prescott (2000) riferisce, come antimicrobico per le enterotossiemie nei bovini causate da C. perfringens, l'utilizzo di penicillina. Scopo di questa ricerca è stato, dunque, trovare un metodo per la determinazione della minima concentrazione inibente di C. perfringens, al fine di essere a conoscenza della sensibilità agli antimicrobici di questo patogeno.

Materiali e metodi
È stato messo a punto un test, in micrometodo, per la valutazione della sensibilità agli antimicrobici di C. perfringens.
Attraverso il test è stata valutata la MIC in ceppi di C. perfringens di diversa provenienza presenti nella ceppoteca batterica, previa una valutazione della presenza di geni codificanti per le principali tossine. Il test sulla valutazione della sensibilità agli antimicrobici di Clostridium perfringens si basa sulle indicazioni del CLSI (NCCLS) per la valutazione della sensibilità di germi anaerobi (CLSI M11-A6).
Sono stati sottoposti a determinazione della MIC i ceppi di C. perfringens isolati da bovino. Ciascun isolato è stato seminato su una piastra di agar sangue al 5% globuli rossi di montone e incubato per 24-48 ore a 37°C in anaerobiosi. Successivamente, è stata allestita una sospensione in Mueller-Hinton Broth corrispondente ad una concentrazione di circa 107ufc/ml e 0,1 mL di questa sospensione sono stati aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra di Sensititre Anaerobe MIC Susceptibility Plates (Trek diagnostic Systems, UK) e incubate a 37°C per 46-48 ore in anaerobiosi.
Un ceppo di Bacteroides fragilis (ATCC 25285) è stato impiegato come controllo. Gli antimicrobici e le relative concentrazioni testate sono state le seguenti:

Amoxicillina+ acido clavulanico: 0.5/0.25 µg /ml; 1/0.5 µg /ml; 2/1µg /ml; 4/2 µg /ml; 8/4 µg/ml; 16/8 µg/ml;

Ampicillina: 0,5 µg /ml; 1 µg /ml; 2 µg /ml; 4 µg /ml; 8 µg /ml; 16 µg /ml;

Ampicillina/sulbactam: 0.5/0.25 µg /ml; 1/0.5 µg /ml; 2/1µg /ml; 4/2 µg /ml; 8/4 µg /ml; 16/8 µg/ml;

Cefotenan: 4 µg /ml; 8 µg /ml; 16 µg /ml; 32 µg /ml; 64 µg /ml;

Cefoxitina: 1 µg /ml; 2 µg /ml; 4 µg /ml; 8 µg /ml; 16 µg /ml; 32 µg /ml;

Clindamicina: 0.25 µg /ml; 0,5 µg /ml; 1 µg /ml; 2 µg /ml; 4 µg /ml; 8 µg /ml;

Cloramfenicolo: 2 µg /ml; 4 µg /ml; 8 µg /ml; 16 µg /ml; 32 µg/ml; 64 µg/ml;

Imipenem: 0.125 µg /ml; 0.25 µg /ml; 0,5 µg /ml; 1 µg /ml; 2 µg /ml; 4 µg /ml; 8 µg /ml;

Meropenem: 0,5 µg /ml; 1 µg /ml; 2 µg /ml; 4 µg /ml; 8 µg /ml;

Metronidazolo: 0,5 µg /ml; 1 µg /ml; 2 µg /ml; 4 µg /ml; 8 µg /ml; 16 µg /ml;

Mezlocillina: 8 µg /ml; 16 µg /ml; 32 µg /ml; 64 µg/ml; 128 µg /ml;

Penicillina: 0.063 µg/ml; 0,125µg /ml; 0.25 µg /ml; 0,5 µg /ml; 1 µg /ml; 2 µg /ml; 4 µg /ml;

Piperacillina: 4 µg/ml; 8 µg/ml; 16 µg /ml; 32 µg/ml; 64 µg/ml; 128 µg/ml;

Piperacillina/tazobactam: 0.25/4 µg /ml; 0.5/4 µg /ml; 1/4 µg /ml; 2/4 µg /ml; 8/4 µg /ml; 16/4 µg /ml;

Tetraciclina: 0.25 µg /ml; 0,5 µg/ml; 1 µg /ml; 2 µg /ml; 4 µg /ml; 8 µg /ml.

La lettura è avvenuta tramite visore ottico; la minima concentrazione inibente è stata definita sulla base della diluizione di antimicrobico più bassa in grado di inibire la crescita batterica.
Esami di PCR multiplex hanno permesso di individuare i geni (cpa, cpb, etx, iap, cpe e cpb2) che codificano rispettivamente per le 4 principali esotossine prodotte quali α, β, ε, ι (Giammarioli, 2003) e per ulteriori 2 tossine minori (cpe, cpb2) (Baums, 2004).

Risultati
Sono stati sottoposti al test 45 stipiti di questo batterio, derivanti da bovini con sintomatologia riferibile a clostridiosi. Mediante PCR ventitré di questi stipiti si sono dimostrati appartenere al tipo A, mentre ventidue erano A β-2. I risultati della MIC sono indicati in tabella 2.



Per la valutazione dei risultati delle varie MIC sono stati impiegati i break-point intepretativi indicati per i batteri anaerobi dalle norme CLSI (CLSI- ex NCCLS M11-A6). Sulla base di questi break-point, i valori di MIC riscontrati si sono collocati nel range della sensibilità per la maggior parte degli antimicrobici.
In particolare, non si sono registrati ceppi resistenti né intermedi per: cefotetan; cefoxitina; imipenem; meropenem; mezlocillina; piperacillina; piperacillina/ tazobactam. Per quanto riguarda i dati relativi alla ampicillina, tre ceppi si sono dimostrati non sensibili; di questi uno presentava anche una MIC elevata per penicillina, classificata come resistente.
Si tratta dell'unico ceppo non sensibile alla penicillina, ed era produttore di tossina β-2.
Due ceppi si sono rivelati non sensibili sia per amoxicillina+ acido clavulanico che per ampicillina/ sulbactam.
Uno stipite è risultato intermedio al metronidazolo. Per cloramfenicolo, sulla base dei break-point indicati dal CLSI, è stato possibile individuare un ceppo intermedio e tre resistenti, mentre per clindamicina, cinque ceppi si sono dimostrati intermedi e nove resistenti.
Infine per la tetraciclina ventinove ceppi hanno mostrato una MIC non sensibile (8 µg/ml), pari alla massima concentrazione testata nel corso del presente lavoro.
Nove dei ceppi risultati non sensibili alla tetraciclina, sono risultati resistenti anche alla clindamicina, (vedi Tabella 3).



Discussione
I valori di sensibilità agli antimicrobici degli stipiti di C. perfringens isolati da bovino non si sono dimostrati preoccupanti; è noto tuttavia che questa specie microbica sia generalmente sensibile agli antibiotici (Goldstein, 2011). Nonostante ciò, si è registrata una certa percentuale di ceppi non sensibili ad alcuni antibiotici appartenenti a classi molto utilizzate negli animali da reddito.
Nell'ambito dei beta-lattamici, in un quadro generalmente favorevole, si è osservata la presenza di alcuni stipiti intermedi o resistenti alla ampicillina e alla penicillina. Più importanti i dati di resistenza riscontrati in altre classi di antibiotici, in particolare, le tetracicline e la clindamicina.
In molti casi questa resistenza è risultata associata. Questo dato è giustificato dal largo impiego di questi antibiotici nelle specie da reddito, ed è stata rilevata da altri autori: ad esempio Slavic' (2011) ha descritto una percentuale del 57.5% di stipiti di C. perfringens da bovino resistenti alle tetracicline.
Per quanto riguarda la clindamicina, questo antibiotico fa parte della classe macrolidi-lincosamidi-streptogramine (MLS), la stessa a cui appartiene anche la tilosina, un farmaco molto utilizzato in medicina veterinaria. Gli antibiotici appartenenti a questa classe presentano fenomeni di resistenza crociata legati alla presenza di un gene erm. È possibile ipotizzare che la resistenza alla clindamicina riscontrata nel corso del presente lavoro sia legata quindi a questo fenomeno. Dal momento che la pratica di ricercare gli anaerobi non è diffusa nei laboratori di medicina umana e veterinaria, e i test di valutazione della sensibilità agli antimicrobici sono raramente applicati in modo sistematico, i profili di resistenza di questa categoria di batteri spesso non sono disponibili o lo sono solo in modo parziale (Goldstein, 2011).

Questa lacuna ostacola la corretta applicazione delle terapie negli animali domestici e non permette di monitorare l'andamento delle resistenze in batteri potenzialmente zoonosici. La possibilità di effettuare delle determinazioni della sensibilità agli antimicrobici di C. perfringens permette il monitoraggio della antibiotico resistenza in questa specie, sia a fini di sanità animale che di salute pubblica.
Per quanto riguarda C. perfringens, la presenza di resistenze ad alcuni antimicrobici largamente utilizzati nella produzione animale, come tetracicline, induce a ritenere che la pressione selettiva abbia un effetto anche in questa specie batterica. Si suggerisce pertanto un monitoraggio periodico della sensibilità in questa specie, per individuare situazioni potenzialmente a rischio.

Bibliografia

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