Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 53 Aprile 2009 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/arretrati/numero-53/mitic04.html
Development of a method for detection of Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in food and particularly in bivalve molluscs - Sviluppo di un metodo per la determinazione degli idrocarburi policiclici aromatici nei cibi con particolare riguardo ai molluschi bivalvi
Stecconi V., Tavoloni T., Lestingi C., Piersanti A.
Abstract. This article is the final report of one year of activity within the Project MITIC of the Voluntary Civil Service carried out at the National Reference Centre for the Microbiological and Chemical control of bivalve shellfish, of Istitituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche of Ancona.
The Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are ubiquitous organic contaminants that can be found in the environment and in food. The sanitary interest for PAH is related to the toxicity exhibited in man. Owing to this carcinogenic property, benzo(a)pyrene is the most studied compound and in some cases it is proposed as an indicator of contamination by PAH. This paper describes the development of a method for the determination, particularly in bivalve shellfish, of 16 carcinogenic PAH described for food in Regulation 1881/2006/EC.
Il presente articolo è l'elaborato finale redatto al termine del periodo di un anno di servizio civile volontario svolto al Centro di Referenza per il controllo microbiologico e chimico dei molluschi bivalvi dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche di Ancona.
Gli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA)sono dei contaminanti organici ubiquitari riscontrabili in tutti i comparti ambientali e negli alimenti. L'interesse sanitario per gli IPA è correlabile alla tossicità da questi esibita nei confronti dell'uomo. Proprio a causa delle sue proprietà cancerogene, il benzo(a)pirene è il composto più studiato ed in alcuni casi viene proposto come indicatore della contaminazione da IPA . Nel seguente lavoro viene descritto lo sviluppo di un metodo per la determinazione dei 16 IPA cancerogeni menzionati nel Regolamento 1881/2006/CE negli alimenti, con particolare attenzione al molluschi bivalvi.
Introduzione
Gli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA) costituiscono una vasta classe di composti organici contenenti due o più anelli aromatici condensati.
Il capostipite di questo ampio gruppo di composti è il naftalene, (Figura 1), il quale viene
commercializzato per le sue proprietà di antitarme ed è costituito da due soli anelli aromatici legati attraverso una coppia di atomi di carbonio.
Figura 1. Naftalene
Gli IPA possono formarsi nel numero di alcune centinaia: più di un centinaio sono stati identificati nel particolato atmosferico e circa duecento nel fumo di tabacco. In Figura 2 è rappresentata la struttura di alcune delle molecole che si possono formare dalla condensazione di anelli benzenici.
L'utilizzo degli IPA è limitato sostanzialmente a scopi di ricerca. Le eccezioni sono rappresentate dal naftalene e da alcuni IPA a basso peso molecolare (naftalene, acenaftene, fluorene, antracene, fenantrene, fluorantene e pirene) occasionalmente utilizzati come intermedi nella produzione di plastificanti, pigmenti, coloranti e pesticidi.
Sorgenti
La formazione degli IPA può essere ricondotta sia a processi tecnologici che a fenomeni naturali dal momento che gli IPA si formano durante la combustione incompleta o la pirolisi di materiale organico, come carbone, legno, prodotti petroliferi e rifiuti.
Il contributo maggiore è fornito sicuramente dalle fonti di origine antropica quali i vari processi industriali di lavorazione del carbone e del petrolio, incenerimento di rifiuti urbani e produzione di energia termoelettrica ecc…. I vulcani a loro volta rappresentano una sorgente naturale di IPA con impatto locale rilevante.
Tossicità
L'interesse che viene mostrato nei confronti di queste molecole è dato dalla loro tossicità verso l'uomo. A causa delle numerose e diffuse sorgenti, gli IPA si ritrovano in tutti i comparti ambientali, nei quali essi entrano soprattutto attraverso l'atmosfera.
Innanzitutto bisogna dire che non tutti gli IPA mostrano gli stessi effetti tossici, ce ne sono alcuni che sono stati identificati come più pericolosi di altri per la salute umana.
Si è osservato che le posizioni relative agli anelli condensati svolgono un ruolo estremamente importante nel determinare la potenziale cancerogenicità per l'uomo. La struttura del Benzo(a)pirene, capostipite degli IPA cancerogeni, mostra una regione definita Regione di Recesso (Bay Region) che si forma a causa di una ramificazione nella sequenza di atomi nell'anello benzenico e conferisce al composto un alto grado di reattività biochimica (Figura 2).
Figura 2. Regione che svolge un ruolo importante nel determinare la potenziale cancerogenicità per l'uomo
Gli IPA non sono di per sé agenti cancerogeni ma possono dare origine a molecole cancerogenicamente attive durante i processi metabolici che subiscono negli organismi viventi.
Ad esempio il processo di Epossidazione con successiva addizione di una molecola d'acqua è una normale reazione metabolica utilizzata dagli organismi viventi per detossificare rendendo le molecole idrofobe come gli IPA più solubili in acqua a seguito dell'addizione di gruppi -OH.
La Figura 3 mostra la sequenza di trasformazioni subite dal Benzo(a)Pirene durante il processo di detossificazione.
Figura 3. Trasformazioni del Benzo(a)Pirene
Normativa
La Commissione Consultiva Tossicologica Nazionale e l'AIRC classificano le sostanze "sicuramente" cancerogene per l'uomo sulla base di studi epidemiologici ed evidenze scientifiche (Tabella 1).
Tabella 1. Classificazione delle sostanze chimiche sulla base della loro cancerogenicità (Commissione Consultiva Tossicologica Nazionale)
Sono "sicuramente" cancerogeni per l'uomo la pece, il catrame, la fuliggine e il fumo di sigarette, tutti prodotti che contengono rilevanti quantitativi di IPA. Alcuni componenti della miscela degli IPA sono classificati invece come probabili cancerogeni per l'uomo sulla base degli studi tossicologici condotti su animali da laboratorio. È impossibile condurre studi epidemiologici sulle singole molecole in quanto gli IPA in natura, proprio a causa della modalità con cui si formano, sono riscontrabili sempre in miscela e con precisi rapporti di concentrazione tra loro a seconda della tipologia della fonte inquinante.
Com'è possibile vedere gli IPA più tossici, il Benzo(a)Pirene (BAP) e il Benzo(a)antracene (BaA) sono stati inseriti nella categoria 2A delle sostanze probabilmente cancerogene per l'uomo ed altri come il Benzo(b)fluorantene (B(b)F), il Benzo(k)fluorantene BkF. il Benzo(j)fluorantene BjF e l'Indeno(1,2,3-cd)pirene (IP) sono catalogati come possibili cancerogeni per l'uomo. Recentemente la CE si è espressa definendo una lista di 8 IPA per cui esistono evidenze sperimentali non equivocabili sulla loro cancerogenicità e come tali possono essere considerati potenziali cancerogeni per l'uomo anche in assenza di dati epidemiologici.
Alcuni decenni fa, l'Agenzia Americana per la Protezione dell'Ambiente (EPA) ha individuato un elenco di 16 IPA (otto di questi IPA sono conosciuti come carcerogeni o genotossici) definiti contaminanti prioritari (Tabella 2).
Nonostante il benzo[a]pyrene contribuisca solo per l'1-20% alla cancerogenesi, la normativa in vigore (1881/2006/CE), lo utilizza come indicatore della contaminazione dai 16 IPA individuati come contaminanti prioritari dall'SFC (Safety Food Committee) nel parere del 04 dicembre 2002.
L'SFC, l'organo tecnico dell'EFSA (Environmnetal Food Safety Agency), ha valutato 33 IPA e dichiarato che l'esposizione a 15 di essi pone in serio rischio la salute umana a causa delle loro proprietà tossiche.
Tabella 2. Rischio per la salute umama degli IPA (Environmnetal Food Safety Agency)
Esposizione dell'Uomo
A questo punto è importante parlare di quali possono essere le principali fonti di esposizione dell'uomo agli IPA. Poichè gli IPA, sono dei contaminanti ubiquitari riscontrabili in tutti i comparti ambientali, sicuramente le principali fonti di esposizione per l'uomo sono aria, acqua, suolo e alimenti attraverso l'inalazione, il contatto dermico e l'ingestione (Figura 4).
Figura 4. Esposizione a IPA cancerogeni da Acqua, Aria, Suolo e Cibo
Visto l'importante contributo dell'alimentazione all'esposizione dell'uomo è necessario sviluppare dei sistemi di controllo per il monitoraggio della presenza dei citati contaminanti negli alimenti.
Sviluppo di un metodo GC-MS per la determinazione multiresiduo dei 16 IPA cancerogeni indicati da 1881/2006/ce negli alimenti
Dalla ricerca bibliografica è emerso che pochi sono ancora i metodi analitici pubblicati in grado di effettuare determinazioni multiresiduali dei 16 IPA del Regolamento 1881/2006/CE e niente è stato sviluppato negli alimenti. Si è mostrata, per tanto, l'esigenza di implementare un metodo che consenta di misurare le concentrazioni dei 16 IPA nel pescato ed in particolare nei mitili.
Nella fase progettuale si è tenuto conto del fatto che il metodo dovesse essere altamente automatizzato, prevedendo l'uso di piccole quantità di reattivi con lo scopo di avere una elevata resa analitica riducendo al minimo il tempo operatore necessario per unità di campione e l'esposizione a sostanze tossiche.
Il processo analitico si suddivide in 4 fasi: liofilizzazione, estrazione, purificazione ed analisi gascromatografica.
Il campione omogeneizzato, portato e mantenuto alla temperatura di -80°C per una notte, viene sottoposto a liofilizzazzione per 6 ore. L'estrazione viene effettuata in condizioni di pressione e temperatura controllata con l'ASE (Accelerated Solvent Extractor), utilizzando diclorometano come solvente, secondo il seguente programma: preriscaldamento 5 min, riscaldamento 5min, static 5min, flush 115%, purge 180 sec, 2 cicli, pressione 1500 psi, temperatura 100°C. La cella di estrazione viene riempita (dal basso verso l'alto) con 8g di Ossido di Alluminio, 6g di Silice e 1g di Solfato di Sodio Anidro ed infine viene aggiunto il campione.
L'estratto viene evaporato al rotavapor e sottoposto a purificazione mediante GPC (gel permeation cromatography) su colonna in vetro 500 mm x 10 mm di diametro impaccata con uno "slurry" costituito da circa 12 g di resina biobeeds SX-3 in diclorometano/cicloesano (1:1) (fase mobile).
Il campione, risospeso nella fase mobile, viene filtrato su filtri in PTFE da 0.45 ?m, iniettato e fatto eluire ad 1 mL/min con una corsa cromatografica della durata di 50 min.
La frazione contenente gli analiti viene raccolta tra 22.3 e 41.3 min.
L'eluato, risospeso con una soluzione di lavoro contenente lo standard interno deuterato, viene iniettato in GC-MS.
La tabella 3 mostra i risultati preliminari delle prove di reperibilità ottenuti addittivando a 100 ng/g sei campioni di vongole giunti al nostro laboratorio.
Tabella 3. Prove di reperibilità nei campioni di vongole perveniti al laboratorio
Il GC 6890N della Hewlett-Packard connesso ad uno spettrometro di massa HP5973 inert è stato utilizzato per l'identificazione e la quantifica degli analiti. Lo strumento, equipaggiato con una colonna RTX-5MS W/integra guard della Superchrom lunga 30m, i.d. 0.25mm e spessore di 0.25um, lavora ad un flusso (carrier: elio) di 1.5ml/min. Il programma della temperatura del forno è il seguente:da 80°C a 200°C a 40°C/min poi, fino a 220°C a 5°C/min, la temperatura viene mantenuta a 220 °C per un minuto, da 220 a 240°C a 2°C/min ed infine fino a 300°C a 12°C/min, temperatura che viene mantenuta per 20 min.
La corsa ha una durata complessiva di 63 min.
1ul di campione viene iniettato con modalità splitless nell'iniettore mantenuto alla temperatura di 300°C. Le molecole vengono ionizzate per impatto elettronico (temperatura della sorgente: 300°C; temperatura quadrupolo: 150; temperatura interfaccia: 280°C) e rilevate in Single-Ion Monitoring (SIM).
La figura 5 mostra il cromatogramma ottenuto in GC-MS iniettando uno standard di tutti gli analiti alla concentrazione di 100 ng/mL, mentre la figura 6 mostra il cromatogramma di un campione di vongole addittivato degli analiti a 100 ng/g.
Conclusioni
Si è sviluppato un metodo ad elevata resa analitica, caratterizzato da un elevato grado di automazione, per la determinazione dei 16 IPA nei molluschi bivalvi con buoni risultati sia per quanto riguarda la ripetibilità che l'accuratezza (Tabella 3).
Si ritiene che il metodo presentato possa essere applicato anche ad altre tipologie di matrici con l'accortezza di aggiungere uno step purificativo in più allo scopo di abbattere il tenore lipidico dei prodotti più grassi per ottenere dei Limiti di Quantificazione (LOQ) adeguati ai Limiti Massimi di Residui previsti dal 1881/2006/CE.
I risultati ottenuti per le performances del metodo da queste prove preliminari, dovranno ovviamente essere confermati dalla validazione sistematica del metodo.
Figura 5. Standard 100ppb
Figura 6. Campione addittivato
BIBLIOGRAFIA
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