Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 53 Aprile 2009 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/arretrati/numero-53/mitic03.html
Microbiologic surveillance of living bivalve molluscs in production areas of Pesaro - Urbino (Italy) district - Sorveglianza microbiologica dei molluschi bivalvi vivi nelle zone di produzione della Provincia
di Pesaro-Urbino
Martinell V., Petruzzelli A., Tonucci F.
Abstract.This paper represents the final report prepared at the end of the period of Voluntary Civil Service carried out by Veronica Martinelli at the Food Safety Laboratory of Pesaro.
It is described in detail the work of 12 months.
This work evaluates the hygienic-sanitary safety of shellfish in the coastal water of the province of Pesaro-Urbino.
Il presente lavoro rappresenta l'elaborato finale redatto al termine del periodo di servizio civile svolto da Veronica Martinelli presso il laboratorio di Sicurezza Alimentare della Sezione Pesaro.
Viene descritto nel dettaglio l'attività svolta nei 12 mesi.
Il presente lavoro ha lo scopo di valutare la qualità microbiologica dei molluschi bivalvi vivi della zona costiera della provincia di Pesaro-Urbino.
Introduzione
I molluschi bivalvi vivi possono costituire un rischio in materia di sicurezza alimentare in quanto, essendo organismi filtratori, potrebbero rappresentare un potenziale serbatoio di agenti patogeni e sostanze tossiche (batteri, virus, microalghe, pesticidi, metalli pesanti, PCB, IPA, isotopi radioattivi).
Lo studio della qualità microbiologica dei molluschi bivalvi vivi fornisce informazioni utili per la tutela della salute pubblica. La raccolta e la commercializzazione dei molluschi bivalvi vivi sono subordinate alla conformità dei parametri chimici definiti dal Regolamento CE 1881/06 e dei parametri igienico-sanitari individuati dai Regolamenti CE 853/04 e 2073/05.
Box 1. Parametri igienico-sanitari - chimici (Regolamento CE 1881/06) - biotossicologici (Regolamento CE 853/04) - microbiologici (Regolamento CE 2073/05)
Il Regolamento (CE) 854/04 prevede che gli Stati membri provvedano a classificare le zone di produzione dei molluschi bivalvi vivi e ad istituire un Sistema di Sorveglianza sulle zone di classificazione e sugli impianti di produzione che permetta un costante monitoraggio della salubrità di tali prodotti e della qualità igienica-sanitaria delle acque.
Classificazione zone marine.
Le zone marine adibite alla raccolta ed allevamento dei molluschi vengono classificate in base a quanto richiesto da specifiche norme europee e nazionali.
La classificazione sanitaria delle acque marine per la produzione dei molluschi bivalvi è definita nell'Allegato II del Regolamento (CE) 854/04 e, per la Regione Marche, dalla Delibera della Giunta Regionale n. 725 del 13 giugno 2005.
Zone di classe A: sono zone in cui i Molluschi eduli lamellibranchi (MEL) raccolti possono essere direttamente destinati al consumo umano poichè soddisfano i requisiti sanitari stabiliti nell'Allegato III, sez.VII, capoV del Regolamento (CE) 853/04: livelli di E. coli minori di 230 MPN per 100 g di polpa e di liquido intervalvare (Regolamento (CE) 2073/05).
Zone di classe B: sono zone in cui i MEL possono essere raccolti ed essere immessi sul mercato ai fini del consumo umano solo dopo aver subito un trattamento in un centro di depurazione o previa stabulazione. I MEL che provengono da queste zone non devono superare i livelli di 4.600 E.coli per 100g di polpa e di liquido intervalvare. Il metodo di riferimento per questa analisi è il test del numero più probabile (MPN) in cinque provette e tre diluizioni specificato nella norma ISO 16649-3. Possono essere usati metodi alternativi se convalidati rispetto al metodo di riferimento secondo i criteri fissati dalla norma EN/ISO 16140.
Zone di classe C: sono zone in cui i molluschi bivalvi vivi possono essere raccolti ed essere immessi sul mercato ai fini del consumo umano solo previa stabulazione di lunga durata. I MEL provenienti da queste zone non devono superare i livelli di 46.000 E.coli per 100 g di polpa e di liquido intervalvare. Il metodo di riferimento per questa analisi è il test del numero più probabile (MPN) in cinque provette e tre diluizioni specificato nella norma ISO 16649-3.
Possono essere utilizzati metodi alternativi se convalidati rispetto al metodo di riferimento secondo i criteri fissati dalla norma EN/ISO16140.
Nelle Figure 1 e 2 sono rappresentate rispettivamente le zone di produzione delle vongole e del Mytilus galloprovincialis della provincia di Pesaro-Urbino.
Tutte le zone oggetto di classificazione vengono identificate mediante coordinate geografiche.
Per quanto riguarda la produzione di vongole, nella provincia di Pesaro-Urbino, sono presenti solo zone di tipo A e B e non zone di tipo C.
Figura 1. Zone di produzione delle vongole della provincia di Pesaro-Urbino
Figura 2. Zone di produzione del Mytilus galloprovincialis della provincia di Pesaro-Urbino
La miticoltura nel nostro Paese si è sviluppata attraverso tre sistemi produttivi:
- sul fondale (utilizzato solo in aree lagunari del delta padano);
- pali fissi (diffuso in zone lagunari o costiere riparate);
- filari galleggianti o long-line.
Il metodo di allevamento dei mitili più diffuso della Regione Marche è il sistema flottante detto long-line (filari galleggianti) (Fig.3, Fig 4).
Figura 3. Metodo di allevamento dei mitili nella Regione Marche: sistema flottante detto long-line
Figura 4. Schema di allevamento con sistema flottante long-line
Tale sistema è costituito da una struttura galleggiante, formata da boe disposte ad intervalli regolari, che mantengono sospesa a circa tre metri di profondità una grossa fune orizzontale, detta "trave" ancorata al fondo. Ad ogni trave sono legate, a distanza regolare l'una dall'altra, le calze contenenti i mitili, dette reste o trecce. Tali strutture sono tubolari di rete in materiale sintetico dove si ancora, già nelle prime fasi di vita in mare, il mollusco. Ogni resta è lunga circa quattro metri, per cui la coltivazione delle cozze avviene nella fascia d'acqua compresa fra i 3 e i 7 metri di profondità. Pur parlando di allevamento, in queste strutture il mollusco non viene alimentato con mangimi, ma si nutre di plancton ottenuto filtrando l'acqua di mare, come il prodotto che vive spontaneamente su scogli e rocce marine. Per questo l'allevamento è considerato di tipo estensivo.
Gli impianti di mitilcoltura devono essere posizionati in zone in cui:
- la struttura fisica del fondale consente l'insediamento della tipologia di allevamento prescelta;
- non devono avvenire frequenti fenomeni distrofici a carico del fondale;
- deve essere garantita, in qualunque condizione meteorologica, la sicurezza della navigazione;
- devono essere limitati l'impatto visivo delle strutture emergenti e quello fisico delle strutture immerse;
- deve essere favorito il rimescolamento del fondale e la dispersione dei residui organici, pseudofeci, e di mitili che si sono staccati dalle strutture di allevamento o che sono derivati dagli scarti di lavorazione;
- la classificazione igienico-sanitaria deve essere di tipo A, cioè adatta alla produzione di molluschi bivalvi vivi da indirizzare direttamente al consumo umano.
La tipologia di allevamento viene scelta in base alla economicità e alle caratteristiche ambientali e meteomarine.
Monitoraggio mitili
Il prelievo dei mitili dalle zone di produzione primaria (allevamenti o banchi naturali) viene eseguito ai fini della classificazione delle acque.
Il monitoraggio presso gli allevamenti di mitili che attuano il sistema a "trecce" viene effettuato raccogliendo cozze pronte per il consumo dalla parte terminale della "resta", a metà, e dalla porzione vicino alla superficie marina, per un totale di circa 4 kg.
Per i banchi naturali si effettua il prelievo direttamente dallo scoglio raggiungendo sempre il peso di 4kg.
I campioni prelevati vengono posti per l'invio in laboratorio in un sacco in rete allegando apposito cartellino che riporta data, luogo e firma dell'esecutore del campionamento.
In concomitanza del campionamento dei molluschi viene eseguito anche il prelievo dell'acqua marina utilizzando un appropriato retino formato da piccolissime maglie (20 µm) in grado di raccogliere acqua e alghe eventualmenti presenti.
Il monitoraggio dei mitili prevede il prelievo di campioni da sottoporre ad analisi microbiologiche, chimiche e biotossicologiche secondo il seguente schema (Piano di sorveglianza delle zone di produzione e stabulazione dei molluschi bivalvi vivi ai sensi del Reg CE 854/04-Regione Marche-20/02/06):
- Analisi microbiologiche: numerazione di E. coli (fino al 2004 anche dei Coliformi), e ricerca di Salmonella spp. Cadenza campionamento trimestrale.
- Analisi chimiche: ricerca piombo, mercurio e cadmio. Cadenza campionamento semestrale.
- Analisi biotossicologiche: ricerca di biotossine algali (PSP: Paralytic Shellfish Poison; ASP: Amnesic Shellfish Poison; Acido okadaico, dinophysitossine e pectenotossine; Yessotossine;
Azaspiracidi ). Cadenza campionamento quindicinale.
Monitoraggio vongole
Il campionamento di banchi naturali di vongole avviene attraverso "Turbosoffianti" (Fig. 5).
Figura 5. Turbosoffiante o "vongolara"
La pesca delle vongole viene effettuata immergendo sul fondale marino un apposito rastrello (in gergo "il ferro"), che viene trascinato dalla barca a ritroso per circa 10 minuti. Le strisciate del rastrello vengono effettuate entro zone di mare prefissate ed idonee alla pesca delle vongole. Per ciascuna zona vengono fatte due strisciate, parallele alla linea di costa, una dove l'acqua ha una profondità compresa fra i 3 ed i 6 metri e una dove ha una profondità fra i 6 ed i 9 metri.
Il pescato ottenuto viene convogliato in un vagliatore rotante che separa i molluschi in base alla dimensione raggiunta, permettendo di reimmettere in mare quelli di piccole dimensioni. Le vongole raccolte devono essere di taglia idonea al consumo e in quantitativo tale da formare un campione di circa 4 kg, che viene confezionato con le stesse modalità delle cozze.
L' attività di sorveglianza sui banchi naturali di vongole viene effettuata secondo il seguente schema (Piano di sorveglianza delle zone di produzione e stabulazione dei molluschi bivalvi vivi ai sensi del Reg CE 854/04-Regione Marche-20/02/06):
- Analisi microbiologiche: numerazione di E. coli (fino al 2004 anche dei Coliformi), e ricerca di Salmonella spp. Cadenza campionamento bimestrale.
- Analisi chimiche: ricerca piombo, mercurio e cadmio. Cadenza campionamento semestrale.
- Analisi biotossicologiche: ricerca di biotossine algali (ASP, DSP, PSP). Campionamento in base a particolari fioriture algali.
Nelle zone di mare classificate per la pesca delle vongole vengono semestralmente effettuati anche campioni di acqua con le stesse modalità e scopi descritti per il monitoraggio dei mitili.
I campioni di mitili e di vongole da analizzare vengono trasportati in condizioni di refrigerazione alle Sezioni territoriali dell'Istituto Zooprofilattico Umbria e Marche; mentre i campioni di acqua marina vengono consegnati ai laboratori dell' Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale delle Marche (A.R.P.A.M.).
Materiali e metodi
In questo lavoro sono stati rielaborati i risultati relativi alle analisi microbiologiche previste dall'attività di Sorveglianza effettuata su 212 campioni di vongole esaminati nel periodo gennaio 2004 - dicembre 2006 nella provincia di Pesaro-Urbino.
Le analisi quantitative (numerazione di coliformi totali e E. coli ) sono state effettuate a partire da 10 g di campione diluito in 90 ml di acqua peptonata tamponata (BPW). Dalla prima diluizione ottenuta (10 -1 ) sono state allestite diluizioni decimali seriali, in Minerals Modified Glutamate Broth (MMGB).
Le analisi qualitative (ricerca di Salmonella spp.) sono state effettuate a partire da 25 g di alimento diluito in 225 ml di terreno di prearricchimento specifico.
Sono state utilizzate le seguenti metodiche ISO:
- Ricerca di Salmonella spp. (ISO/TS 6579:2004): prearricchimento di 25 g di prodotto in 225 ml di acqua peptonata tamponata (BPW), incubazione a 37°C per 20 h. Arricchimento selettivo in Rappaport Vassiliadis semisolido (MSRV) e Mueller-Kauffmann tetrationato-novobiocina (MKTTn) e incubazione rispettivamente a 42°C e 37°C per 24 h .
- Numerazione di E. coli (e coliformi totali) (ISO/TS16649-3:2005): Metodo MPN: Modified Glutamate Broth (MMGB) e incubazione a 37°C per 24 h.
Coliformi positivi: viraggio del terreno al giallo. Dalle provette positive per coliformi determinazione E. coli β-glucorononidasi positivi: Triptone Bile glucoronide agar (TBGA) e incubazione a 44°C per 24 h. Colonie tipiche: colonie blu-verdi.
Per l' omogenizzazione del campione è stato utilizzato l'omogenizzatore Stomacher 400 Steroglass (PBI international) (Fig.6 ).
Figura 6. Omogenizzatore Stomacher 400 Steroglass
Risultati
I risultati ottenuti sono stati valutati sulla base dei limiti individuati dalla normativa vigente (Reg CE 2073/05). I risultati sono stati interpretati in base a quanto indicato dall'Intesa Stato-Regioni del 25 gennaio 2007 ed in particolare come segue:
E. coli: Soddisfacente se tutti i valori osservati sono pari o inferiori al valore limite
Insoddisfacente se uno dei valori è superiore al valore limite>;
Salmonella: Soddisfacente se tutti i valori osservati indicano l'assenza del batterio
Insoddisfacente se si rileva la presenza del batterio.
Gran parte dei campioni analizzati sono risultati negativi per Salmonella spp, in particolare sono state rilevate 2 positività rispettivamente in maggio 2005 (area BF3-6m) e nel luglio 2005 (area A7.16-9m).
La contaminazione da E.coli è riportata nei grafici 1 e 2 per l'anno 2004, nei grafici 3 e 4 per l'anno 2005 e nei grafici 5 e 6 per l'anno 2006.
Nel grafico 7 sono riportate le percentuali di non conformità relative ad E.coli negli anni 2004, 2005, 2006.
Grafico 1. Contaminazione da E.coli per l'anno 2004, Aprile - Agosto
Grafico 2. Contaminazione da E.coli per l'anno 2004, Settembre - Dicembre
Grafico 3. Numerazione E coli anno 2005 (Marzo- Maggio)
Grafico 4. Numerazione E coli anno 2005 (Giugno - Luglio)
Grafico 5. Numerazione E coli anno 2006 (Marzo - Agosto)
Grafico 6. Numerazione E coli anno 2006 (Settembre - Ottobre)
Grafico 7. Campioni di MEL conformi e non conformi
Discussione e conclusioni
Un'esigua percentuale di campioni (0,9 %) è risultata non conforme per i parametri di sicurezza alimentare (Salmonella spp) mentre la contaminazione da E. coli è risultata di maggior rilievo. Infatti nell'anno 2004 sono risultati non conformi per E. coli il 9,4 % dei campioni analizzati, nell'anno 2005 l'11,6 % e nell'anno 2006 l' 8,1 %.
In particolare l'80% dei campioni non conformi è stato rilevato nelle zone di produzione classificate come zone A mentre il 20% nelle zone B.
Nell'anno 2004 le non conformità sono state rilevate nelle zone A 2.1, A 2.2, A 3.1, A 3.2, A4, BA e BE, nell'anno 2005 nelle zone A 2.1, A 2.2, A 3.1, BA, BE con un solo campionamento non conforme per la zona A7.
Essendo stati rilevati campioni non conformi nelle stesse zone A (A 3.1, A 3.2, A4) per un tempo prolungato (2002-2004) si è proceduto alla riclassificazione delle stesse in zone di tipo B, al contrario la zona BF è stata riclassificata in zona di tipo A in base ai risultati conformi dei campioni prelevati (Fig. 1) (Delibera della giunta Regione Marche del 13/06/2005).
Nell'anno 2006 sono seguiti campionamenti nelle zone riclassificate rilevando non conformità per E. coli nelle zone A 6.1 e A 6.2.
La contaminazione da E. coli è stata rilevata soprattutto in campioni prelevati tra la linea batimetrica dei 3 e 6 metri. Ciò evidenzia una maggior contaminazione fecale delle acque prossime alla costa.
Inoltre i campioni non conformi sono stati rilevati soprattutto nelle zone costiere di Pesaro ciò fa pensare ad un maggior inquinamento delle acque da parte di reflui urbani non adeguatamente bonificati.
Pertanto, sarebbe opportuno effettuare un maggior controllo degli impianti di depurazione dei reflui di scarico.
Nell'analisi dei risultati sarebbe utile correlare le non conformità ottenute con le condizioni meteomarine in modo da associare eventuali contaminazioni dei campioni di molluschi ad un preciso quadro microbiologico delle acque marine.
Dallo studio effettuato risulta evidente l'importanza di una puntuale e rigorosa applicazione dei Piani regionali di sorveglianza per il controllo dei molluschi bivalvi vivi ai fini di un'efficace attività di prevenzione a tutela del consumatore.
BIBLIOGRAFIA
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Bourgeois C.M., Mesele J.F., Zucca J. (1990). Microbiologia alimentare. Aspetti microbiologici della sicurezza e della qualità, Tecniche Nuove, Milano (pp: 119-127, 166-176, 290-292).
EN/ISO 16140: "Microbiology of food and animal feeding stuffs- Protocol for the validation of alternative methods".
ISO 6579: 2004 "Microbiology of food and animal feeling stuffs - horizontal method for the detection of salmonella spp.".
ISO/TS 16649-3:2005 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - horizontal method for the enumeration of the beta-glucuronidase-positive escherichia coli- part 3 : most probable number technique using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-d-glucuronide".
Intesa , ai sensi dell'articolo 8, comma 6, della legge 5 giugno 2003, n.131, tra il governo, le regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano relativa alle linee guida sui molluschi bivalvi e alla nuova regolamentazione comunitaria.
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Regolamento CE n. 853/2004 del parlamento europeo e del consiglio che stabilisce norme specifiche in materia di igiene per gli alimenti di origine animale.
Regolamento CE n. 854/2004 del parlamento europeo e del consiglio del 29 aprile 2004 che stabilisce norme specifiche per l'organizzazione di controlli ufficiali sui prodotti di origine animale destinati al consumo umano.
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Regolamento CE n. 1881/2006: riguarda i tenori massimi di contaminanti chimici nelle deterrate alimentari.
Piano di sorveglianza delle zone di produzione e stabulazione dei molluschi bivalvi vivi ai sensi del Reg CE 854/04-Regione Marche-20/02/06.
