Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/arretrati/numero-53/002.html

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Abstract. Enzootic Bovine Leukosis is contagious disease of cattle caused by the retrovirus (bovine leukaemia virus - BLV). The disease causes fatal malignant cancer in a small percentage of infected animals and can be responsible for major economic losses. Diagnosis of the disease is based primarily on detection of antibodies in serum. The disease can be eradicated by testing and elimination of reactors. In this paper, a panel of samples derived from seropositives animals were examined by histological test to investigate the occurrence of lynfosarcoma.

La Leucosi Bovina Enzootica è una malattia contagiosa del bestiame bovino causata da un retrovirus (virus della leucemia bovina - BLV). La patologia causa tumore maligno in una limitata percentuale di animali infetti ed è responsabile di notevoli perdite economiche. La diagnosi della patologia è basata in primo luogo sul rilevamento degli anticorpi nel siero. La malattia può essere eradicata testando ed eliminando i soggetti positivi. In questo lavoro, un assortimento di campioni derivati da animali sieropositivi è stato esaminato attraverso test istologici per indagare il verificarsi di linfosarcoma.

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Introduzione
Il riscontro di linfosarcoma nel bovino non è frequente nel nostro paese ed è stato occasionalmente descritto solo come reperto di macellazione. Questa forma tumorale si può classificare su base epidemiologica ed eziologica in una varietà enzootica e in una varietà sporadica.
La forma sporadica può essere ulteriormente distinta in: Leucosi cutanea che colpisce animali di età compresa tra 1-3 anni, Leucosi giovanile a carico di vitelli al di sotto dei 6 mesi, Linfoma timico legato all'evoluzione appunto del timo e quindi a carico di soggetti di circa 6-18 mesi.

La forma enzootica colpisce prevalentemente i bovini adulti ed è di origine virale. L'agente eziologico, il virus della leucemia bovina (BLV), è un Retrovirus appartenente al genere Deltaretrovirus e può essere trasmesso per via orizzontale attraverso i linfociti B infetti.

La prevalenza della Leucosi Bovina Enzootica (LEB), è sensibilmente diminuita grazie al piano di eradicazione obbligatorio in Italia dal 1996. Restano tuttavia nel territorio "code" di persistenza dell'infezione la cui eliminazione appare più problematica del previsto, contribuendo a porre il livello sanitario del nostro paese su un piano decisamente inferiore rispetto a quello di altri paesi dell'Unione Europea.

Un ulteriore impulso alla campagna di eradicazione è stato recentemente ottenuto con l'Ordinanza del Ministero della Salute 14.11.2006 "Misure straordinarie di polizia veterinaria in materia di tubercolosi, brucellosi bovina e bufalina, brucellosi ovi-caprina e leucosi nelle regioni Calabria, Campania, Puglia e Sicilia". L'ordinanza prevede un'intensificazione dei controlli e norme più restrittive in tema di identificazione degli animali.

Le tradizionali metodiche diagnostiche, comunemente impiegate per le infezioni sostenute da Retrovirus, si basano essenzialmente sulla sierologia. Per quanto riguarda la LEB, sono andate sviluppandosi anche metodiche diagnostiche biomolecolari che trovano, tra l'altro, un'utile applicazione nella diagnosi della forma tumorale. L'esame istologico, infatti, non consente di differenziare la forma sporadica da quella enzootica e per questo motivo, in sede di conferma, è utile prevedere l'utilizzo in associazione di diversi test.

Materiali e metodi
Al CEREL vengono routinariamente inviati campioni per la conferma diagnostica di Leucosi Bovina Enzootica. Nell'ambito dell'applicazione dell'O.M. 14.11.2006, è stato inoltre previsto l'obbligo di prelievo dei seguenti campioni in sede di macellazione di capi infetti o sospetti infetti di LEB:

1. campione di siero
2. campione di sangue intero non coagulato (EDTA)
3. campioni di organi linfatici (Milza, Linfonodi Perirenali, Sopramammari, Mediastinici Peribronchiali

Questi campioni devono essere inviati al Centro di Referenza Nazionale per lo studio dei Retrovirus correlati alle patologie infettive dei ruminanti (CEREL) scortati dall'allegato F all'O.M. che rappresenta la scheda di rilevamento dati al macello. Il protocollo diagnostico del CEREL prevede di eseguire i seguenti esami diagnostici:



Test sierologici: i test sierologici impiegati sono quelli previsti dalla normativa vigente ed in particolare dal DM 358 del 2-5-1996 e dal D.Lgs. 196 del 22-5-1999. Il test AGID è stato condotto secondo quanto descritto nel Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2008 chapter 2.4.11. pubblicato dall'Office International des Epizoties (OIE). È stato impiegato un antigene prodotto dall'IZS Umbria e Marche costituito da una proteina ricombinante del BLV (gp51) espressa mediante baculovirus.

Il siero di riferimento positivo è stato scelto tra quelli in dotazione del Centro di Referenza Nazionale. Il test ELISA è un test home made in uso routinariamente presso il CEREL: si tratta di un ELISA di tipo sandwich basato su un anticorpo monoclonale anti gp51 adsorbito alla piastra, un antigene ricombinante gp51 e un anticorpo monoclonale anti bovino coniugato con perossidasi. Entrambe le tecniche sono state standardizzate come previsto dalla normativa sulla base dei sieri di riferimento internazionali.

Test PCR: Il DNA dei campioni di linfonodi e milza è stato estratto da omogenati di pool di organi provenienti dallo stesso animale, mediante applicazione di un protocollo che prevede l'utilizzo di QUIAamp DNA Blood mini kit (Qiagen). Per i campioni di sangue intero il materiale è stato preventivamente sottoposto a purificazione al fine di ottenere leucociti dai quali si è successivamente proceduto all'estrazione del DNA provirale in accordo con le istruzioni fornite dal produttore, (QUIAamp DNA Blood mini kit (Qiagen).

Il DNA estratto è stato amplificato utilizzando primers in grado di identificare (amplificare) un frammento di 380bp del gene ENV che codifica per una regione altamente conservata della glicoproteina di superficie gp51.

Le sequenze dei primers utilizzati sono di seguito riportate:

gp51FW S380 CTC TTC TGT GCC AAG TCT CC
gp51 RV AS380 CTG ACA GAG GGA ACC CAG TC

Test Istologico: i campioni sono stati fissati in formaldeide al 4% per almeno 24h. I pezzi dopo adeguata riduzione, sono stati disidratati mediante passaggio in una serie crescente di alcool etilico, chiarificati in xilolo, impregnati ed inclusi in paraffina. Il processo di inclusione è stato attuato mediante l'uso di processatore automatico (Leica TP 1050) e di dispensatore di paraffina (Leica EG 1140 H). Dai blocchetti così ottenuti, dopo raffreddamento, sono state tagliate con microtomo a slitta (Leitz) sezioni sottili dello spessore di 4-5 micron e allestiti i vetrini.

Le sezioni sono state poi colorate con ematossilina-eosina mediante coloratore automatico (Leica Autostainer XL V1.81). Dopo montaggio con vetrino coprioggetto, i preparati sono stati osservati al microscopio ottico (Leica mod. DMR Fluo HC).

Risultati e discussione
I campioni esaminati dal CEREL nel 2007 sono riassunti nella tabella seguente:



I campioni positivi all'esame istologico derivavano da 5 bovini provenienti da diversi allevamenti di cui uno soltanto era stato allevato in Umbria, mentre la derivazione degli altri animali era da riferire alle regioni soggette all'Ordinanza Ministeriale.





Il soggetto proveniente dall'Umbria era un vitello risultato negativo sia al test PCR su matrice sangue ed organi (Milza e Linfonodi) sia ai test sierologici.
Negli altri soggetti in cui sono state riscontrate lesioni riconducibili a linfosarcoma, i risultati dei test biomolecolari e sierologici hanno confermato la presenza di BLV. Nell'ambito dei test biomolecolari e soprattutto dei test istologici diversi campioni sono stati giudicati non idonei all'esecuzione delle prove. Tutto ciò é stato causato dalle modalità di conservazione e spedizione dei campioni: le basse temperature infatti hanno causato il congelamento dei campioni stessi e quindi un'emolisi dei campioni di sangue inviati per il test PCR e un'alterazione del profilo istologico dei campioni d'organo.



I risultati ottenuti dimostrano che la prevalenza di linfosarcoma nei bovini in Italia è sottostimata. I resoconti inviati dal Ministero della Salute all'Unione Europea negli ultimi anni, infatti, ne riportano pochissimi casi, ma l'applicazione dell'Ordinanza Ministeriale del 14.11.2006 ha già fatto emergere quello che si potrebbe definire un epifenomeno. Non stupisce, infatti, il linfosarcoma rinvenuto in Umbria riferibile alla varietà sporadica giovanile, ma rimangono da interpretare i quattro casi provenienti da Regioni del Meridione in cui non è mai stata segnalata la presenza di linfosarcomi. L'età degli animali risultati positivi per linfosarcoma oscillava trai 4 e i 6 anni e ciò rappresenta un fattore epidemiologico a sostegno delle forme tumorali di LEB riscontrate.

Questo lavoro dimostra ancora una volta la necessità di costituire nel mattatoio un vero e proprio punto di osservazione epidemiologica specialmente nel monitoraggio dei tumori animali.

Bibliografia

1. "Evaluation of diagnostic tests to bovine leukemia virus" Marcelo F. Camargos, Francesco Feliziani, Antônio De Giuseppe, Leandro M. Lessa, Jenner K. P. Reis, Rômulo C. Leite Revista Portugesa de Ciências Veterinárias, 169-173

2. DM 2 Maggio 1996 n° 358: "Regolamento concernente il Piano Nazionale per l'Eradicazione della Leucosi Bovina Enzootica"

3. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals edition 2008 chapter 2.4.11. Office International des Epizoties http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/ 2008/pdf/2.04.11_EBL.pdf

4. "Produzione e purificazione mediante cromatografia per affinità della proteina gp51 del virus della Leucosi Bovina Enzootica (BLV) ricombinante deleta " Katia Forti, Francesco Feliziani, Giulio Severi, Simone Marcaccio, Miriam Menichelli, Giovanna Ferrante, Antonio De Giuseppe Workshop nazionale di Virologia Veterinaria - Diagnostica ed epidemiologia delle infezioni virali degli animali domestici - Facoltà di Medicina Veterinaria Università di Bologna riassunti p. 37; 7-8/06/2007

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