Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 52 Febbraio 2009 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://www.spvet.it/arretrati/numero-52/001.html
Behaviour of pathogens microorganisms in fresh-produced salads - Comportamento di microrganismi patogeni in insalate di IV gamma
Morgante R.A., Mencaroni G, Scuota S., Cenci T.
Abstract. Given the increasing interest of consumers for minimally processed vegetables and the consequent increase in consumption, a microbiological challenge test was conducted to assess the level of food security that this type of product will ensure. For this reason, a samples of lettuce were experimentally contaminated with strains of pathogens such as Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica. The samples were analyzed immediately after the contamination, 3 days and 6 days after incubation at 4 º C ± 1 º C. Behavior of pathogenic microorganisms showed a reduction of Salmonella and an increase of Listeria and Yersinia. The latter ones, as psicrotropi, represent a potential danger in this type of food.
Introduzione
Negli ultimi anni si è assistito ad un forte aumento di consumi degli alimenti ad alto valore aggiunto, che grazie alle innovative modalità di conservazione e confezionamento consentono ai consumatori di ridurre i tempi di preparazione dei pasti. I prodotti di IV gamma sono prodotti di recente introduzione sul mercato ortofrutticolo e figurano in questa categoria di prodotti.
Sono prodotti ortofrutticoli freschi che, dopo aver subito operazioni di mondatura, taglio, lavaggio ed asciugatura, vengono confezionati in sacchetti o in contenitori coperti da un film plastico trasparente dotato di permeabilità selettiva ai gas; le confezioni, di peso variabile dai 100 ai 500 grammi sono fornite, in molti casi, anche di condimento.
Si adattano bene alle esigenze del consumatore grazie alla praticità d'uso, permettendo un notevole risparmio di tempo, anche se questo vantaggio incide non poco sul prezzo finale, tanto da far aumentare di 5-6 volte il costo del prodotto di IV gamma, rispetto al prodotto di partenza (7).
Sono caratterizzati da una quota di mercato pari all'8% rispetto al totale del comparto ortofrutticolo ed un tasso di crescita medio annuo, dal 2001 ad oggi, del 18,6%.(2)
L'igiene e la sanità della materia prima influisce direttamente sulla qualità del prodotto, analogamente a: pratiche colturali (tipo di concimazione, acqua d'irrigazione, uso di disserbanti ed insetticidi, ecc.), cultivar scelte, condizioni pedoclimatiche, epoca e modalità di raccolta, ecc. Ad incidere in modo non trascurabile sulla qualità del prodotto sono anche tutte le operazioni di preparazione e commercializzazione, con particolare riferimento al rispetto della catena del freddo lungo tutta la filiera di produzione e vendita.
Essendo prodotti pronti all'uso, che spesso non richiedono, da parte del consumatore, altri trattamenti in grado di eliminare o ridurre a un livello accettabile gli agenti patogeni eventualmente presenti, possono rappresentare dei potenziali veicoli di agenti eziologici, di origine batterica, virale e protozoaria.
La flora batterica che normalmente caratterizza questi prodotti è molto eterogenea e include germi per la maggior parte psicrofili, appartenenti, ai generi Pseudomonas, Erwinia, Acinetobacter, Flavobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, oltre a Corynebacterium, lieviti, muffe, ecc. (1,5).
Quale conseguenza diretta dei fenomeni catabolici dei tessuti vegetali che si realizzano anche dopo il confezionamento, si verifica un aumento della concentrazione di CO2 all'interno del contenitore, che riesce a rallentare, ed in alcuni casi ad inibire, lo sviluppo della flora microbica presente realizzando, di fatto, una condizione di atmosfera modificata.
Non è possibile stabilizzare il prodotto operando trattamenti tecnologici di tipo chimico o fisico, quindi, le uniche possibilità di contenimento dei processi degenerativi sono legate al rispetto delle temperature di refrigerazione lungo tutta la filiera di produzione.
In genere la shelf-life dei prodotti di IV gamma commercializzati varia da 5 ad 8 giorni; oltre questo tempo intervengono delle alterazioni qualitative (imbrunimento, rammollimento, ecc) operate da enzimi sia batterici sia propri della cellula vegetale, tali da comprometterne le caratteristiche organolettiche ed igienico-sanitarie.(4,6)
Proprio per valutare l'alimento da un punto di vista igienico-sanitario, si è fatto ricorso ad un challenge test microbiologico. Lo studio delle curve di sviluppo che alcuni agenti patogeni possono avere in questo tipo di prodotto è servito per caratterizzare meglio il livello di sicurezza che l'alimento è in grado di offrire al consumatore.
Challenge test microbiologico
Per molti anni, le aziende che operano nel settore, hanno fatto riferimento, in modo volontario, ai limiti definiti della normativa francese (DGCCFR-1988) perché unico paese europeo in possesso di una normativa specifica per questi prodotti. Con l'entrata in vigore del Reg.CE 2073/05, che fa esplicito riferimento a frutta ed ortaggi pre-tagliati, si stabiliscono limiti microbiologici che mirano a valutare l'igiene del processo di lavorazione del prodotto e stabiliscono dei criteri di sicurezza alimentare. Inoltre lo stesso Regolamento prevede che, se necessario, gli Operatori del settore alimentare effettuino prove per determinare la capacità che i microrganismi di riferimento hanno di sviluppare nel prodotto (3).
Le garanzie di sicurezza alimentare che il produttore è in grado di offrire, sono quindi, strettamente correlate all' andamento delle curve di crescita di germi patogeni quali Listeria monocytogenes, Salmonella spp e Yersinia enterocolitica, che per le caratteristiche di patogenicità, velocità di moltiplicazione oltre che per la possibilità di crescita alle temperature di refrigerazione (Listeria e Yersinia), rappresentano i principali patogeni di riferimento per il controllo sanitario in questi prodotti.
La temperatura di incubazione utilizzata per la prova, cioè di 4° C ± 1° C, è quella consigliata nelle fasi di stoccaggio e commercializzazione per l'insalata di IV gamma, mentre la durata della prova coincide con la shelf-life del prodotto, che è mediamente determinata in 6 giorni.
Materiali e metodi
Ceppi batterici
Per la contaminazione sono stati utilizzati i seguenti ceppi batterici:
- Listeria monocytogenes isolato da insalata di IV gamma in precedenti ricerche
- Salmonella typhimurium ceppo ATCC 14028
- Yersinia enterocolitica ceppo ATCC 27729
I ceppi sono stati coltivati singolarmente in BHI per 24 h a 37°C±1°C in modo da ottenere una carica batterica stimata di 107-108 UFC/ml.
Campionamento e contaminazione
La contaminazione è stata condotta su insalata mista a foglia larga (lattuga, radicchio e scarola), prelevata in un'azienda specializzata nella produzione di insalata di IV gamma, al termine della fase di confezionamento. Opportunamente refrigerata, è stata trasportata al laboratorio di microbiologia degli alimenti dell'IZSUM dove è stata eseguita la prova.
Prima di procedere alla contaminazione dell'insalata, è stato prelevato un campione (controllo negativo) sul quale è stata effettuata la ricerca di Listeria monocytogenes, Salmonella spp e Yersinia enterocolitica. La ricerca degli stessi patogeni è stata condotta subito dopo la contaminazione (tempo 0), dopo 3 giorni e dopo 6 giorni (fine shelf life).
I campioni contaminati sono stati mantenuti a 4°C±1°C per tutto il tempo della prova.
Per la contaminazione del campione si è proceduto nel seguente modo:
- Ogni brodocoltura allestita è stata diluita, utilizzando soluzione sale peptone, in modo tale da ottenere una sospensione batterica stimata contenente 103-104 ufc/ml. L'operazione è stata ripetuta per ogni patogeno in esame ottenendo tre soluzioni corrispondenti ai tre patogeni in esame. Contemporaneamente è stata allestita un'altra sospensione, indicata come MIX, nella quale i tre ceppi batterici sono stati riuniti in un'unica sospensione batterica, dove ciascun patogeno, era presente con una carica batterica stimata di 103-104 ufc/ml.
- In ogni sospensione batterica è stato immerso un quantitativo di 300g d' insalata e lasciato in agitazione per 10 min. a temperatura ambiente.
- Dopo averla recuperata, l'insalata è stata lasciata sgocciolare per 5 min su un apposito telaietto.
- ogni quantitativo di 300g è stato diviso a sua volta in tre aliquote da 100g. Di queste la prima è stata sottoposta, immediatamente alle prove di numerazione; le altre due aliquote contaminate sono state incubate a 4°C±1°C ed analizzate rispettivamente a 3 ed a 6 giorni dalla contaminazione. L'operazione è stata eseguita per l'insalata contaminata con ogni singolo patogeno e per quella allestite per la prova MIX.
- Per tutte le operazioni del campionamento sono state utilizzate buste da Stomaker sterili e sigillate con clip in plastica in modo da assicurare la chiusura ermetica del campione per il tempo e le condizioni necessarie all'esecuzione della prova.
Determinazioni analitiche
Per ogni campione sono stati valutati, i seguenti parametri:
- Numerazione della carica mesofila totale, effettuata secondo la Norma ISO 4833:2003 (8)
- Numerazione della carica psicrofila totale, effettuata secondo la Norma ISO 17410:2001 (9)
- Numerazione dei coliformi totali, effettuata secondo il metodo AFNOR BRD 07/8-12/04 (10).
La numerazione dei germi patogeni è stata eseguita su 10 g del campione contaminato con il patogeno corrispondente, effettuando una semina per spatolamento dell'omogenato in acqua peptonata tamponata su idonei terreni selettivi e precisamente:
- Numerazione di Salmonella su BGA (brilliant green agar) a 37°C±1 per 48h e RA (Rambach) 37°C±1 per 48h.
- Numerazione di Listeria effettuata secondo la Norma ISO 11290-2:2005 (11).
- Numerazione di Yersinia in doppio su Cin agar a 30°C±1 per 48h.
Per la prova MIX sono stati numerati tutti e tre i patogeni utilizzati.
Risultati e discussione
Tutti i campioni di controllo analizzati per la ricerca dei patogeni utilizzati per il challenge test hanno dato esito negativo.
Dall'analisi dei risultati ottenuti dalla sperimentazione, si può osservare, come elemento comune a tutte le prove, la tendenza all'aumento dei valori della carica batterica totale a 30°C, a 5°C e dei coliformi, nel corso dei sei giorni considerati per l'incubazione.
Le cariche dei coliformi mostrano valori di partenza intorno a 4 log che al termine della prova sono aumentati di circa 1,5-2 log.
Tendenza analoga è mostrata dalla carica batterica totale a 30°C ed a 5°C per le quali i valori finali superano in tutti i casi i 7 log, con un incremento di almeno 1 log nel periodo di osservazione.
Non si apprezzano differenze significative tra le cariche batteriche a 30°C e a 5°C nelle singole prove.
Il numero dei germi patogeni è riferito al valore della media aritmetica ottenuta dai conteggi effettuati sulle due piastre di terreno selettivo utilizzato per la conta. I valori ottenuti per Salmonella spp (Grafico 1), per la quale non si osservavano differenze significative nel numero delle colonie nei due terreni utilizzati per la conta, mostrano come nelle condizioni della prova, si assiste ad una riduzione di circa un log della concentrazione di salmonella, passando da 4,6 a 3,5 log. Le condizioni di temperature non favorevoli, associate alla presenza di una considerevole flora microbica competitiva, principalmente composta da germi psicrofili, può probabilmente giustificarne il decremento.
Le cariche di partenza di Listeria monocytogenes e Yersinia enterocolitica mostrano valori inferiori rispetto a Salmonella spp. (grafici 2 e 3) probabilmente perché è stata sovrastimata la concentrazione di partenza. Infatti, nel campione esaminato al tempo 0, per entrambi i patogeni, i valori corrispondenti sono vicini al limite di rilevabilità del metodo utilizzato per la numerazione (10 UFC/g), valori che comunque mostrano un netto incremento del valore durante l'incubazione, passando dopo sei giorni a valori di 350 ufc/g per Listeria monocytogenes e di 240 ufc/gr per Yersinia enterocolitica, confermando le loro caratteristiche psicrotrope.
I valori delle cariche riscontrate per i patogeni nella prova MIX sono sovrapponibili a quelle osservate, confermando quanto già evidenziato nelle singole prove (Grafico 4).
Conclusioni
Dai dati sperimentali ottenuti si può affermare che i germi patogeni utilizzati e dotati di caratteristiche psicrotrope, hanno buone capacità di crescita in questo tipo di alimento rappresentando quindi un pericolo concreto e non trascurabile.
La tendenza alla diminuzione di Salmonella osservata nella prova, permette di considerare questo patogeno, un pericolo legato al grado di contaminazione della materia prima o ad un mancato rispetto delle norme igieniche durante la produzione piuttosto che un pericolo associato alla capacità di sviluppare nel prodotto correttamente conservato.
L'incremento dei valori della carica batterica totale e dei coliformi, in relazione al tempo di stoccaggio, analogamente a quanto osservato per Listeria e Yersinia, conferma la stretta correlazione tra la carica di partenza del prodotto appena confezionato a quella posseduta dal prodotto alla fine della shelf-life.
Il rischio risulta ulteriormente incrementato considerando l'abituale ricorso, da parte delle aziende di produzione, allo stoccaggio in celle frigorifere a basse temperature di refrigerazione, (0+/-0,5°C) in modo da assicurare l'approvvigionamento di materie prime per un periodo dell'anno più lungo ed includendo periodi dell'anno non favorevoli alla coltivazione. Questa prassi facilita il selezionamento di popolazioni batteriche psicrofile che influenzano negativamente l'igiene e la sanità del prodotto.
Va considerato inoltre che la maggior parte di questi alimenti sono pronti all'uso, cioè non richiedono al consumatore ulteriori operazioni che consentano di ridurre i valori delle cariche batteriche che questi prodotti sono in grado di veicolare direttamente nel piatto del consumatore finale.
In conclusione, visto l'incremento di popolarità delle insalate di IV gamma che negli ultimi anni hanno conquistato fasce di mercato sempre più ampie ed alla luce dei nuovi regolamenti europei sull'igiene degli alimenti, risulta sempre più necessario che l'intera filiera garantisca al consumatore un alimento sicuro da un punto di vista igienico sanitario.
Bibliografia
1. Mioni R. et al.: "Valutazione igienico sanitaria dei prodotti vegetali della IV gamma prodotti e commercializzati nel territorio nazionale: dati preliminari. Atti XIII Conferenza Nazionale. "La sicurezza microbiologica nella produzione di alimenti per il 21° secolo. Microbiologia degli alimenti conservati in stato di refrigerazione". Bologna, 2005, pag.129 -132.
2. Baldi L. "Speciale IV Gamma: Evoluzione e prospettive del settore" Informatore agrario. 2007/16, 41-45.
3. Regolamento (CE) n. 2073/2005 della Commissione Europea del 15.11.2005 sui criteri
microbiologici applicabili ai prodotti alimentari.
4. Catellani P., Giaccone V., Novelli E. "STUDIO DELLA FLORA MICROBICA NEI VEGETALI DI IV GAMMA. NOTA PRELIMINARE" Atti del LIX Convegno nazionale Convegno SISVET. Viareggio. 2005, Pag. 397-398.
5. La Rosa Rosa et al.: "Valutazione igienico-sanitaria di vegetali di I e IV gamma prodotti in Sicilia". Industrie Alimentari- XLVI (2007) marzo. Pag. 259-266.
6. Morgante RA. et al.:" Indagine conoscitiva sui vegetali di IV gamma". - Sanità Pubblica Veterinaria - Nuova Serie, numero doppio n. 50-51, Dicembre 2008, Vol. IX http://spvet.it/.
7. F. Lunati. "Vola la IV gamma, gli ortaggi si sono evoluti". Agricoltura, ottobre 2007,Pag. 51-53.
8. ISO 17410:2001: "Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the enumeration of psychrotrophic microorganisms".
9. ISO 4833:2003: "Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the enumeration of microorganisms -- Colony-count technique at 30 °C".
10. AFNOR BRD -07/8 - 12/04: "Numerazione di Coliformi a 37°C".
11. UNI EN ISO 11290-2:2005: "Metodo orizzontale per la ricerca e la conta di Listeria monocytogenes- Parte 2 : Metodo per la Conta"
