Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 50-51 Dicembre 2008 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://www.spvet.it/arretrati/numero-51/002d.html


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Epidemiological Study on Staphylococcus aureus isolated by cow milk: Preliminary considerations - Considerazioni preliminari sullo studio epidemiologico intrapreso su ceppi di Staphylococcus aureus isolati da latte bovino


Morgante R.A., Sambuco L., Spaccini G., Dionisi A. M., Valiani A.


Abstract. 32 bacterial strain of S. aureus has been isolated from samples of bovine milk analyzed in order to search for germs causing mastitidis.
Samples submitted to the Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) technique have highlighted phylogenetics correlation. The genetic variability measured amongst bacterial strains coming from different breeding facilities and the correspondence of the bacterial strains pulsotypes isolated in the same breeding confirm the PFGE as one of the better techniques for the epidemiologic study of S. aureus. In this way a new approach to the medical treatment of mastitidis in milk breedings may arise.


Introduzione
Tra le cause di mastite bovina, quella batterica è certamente la principale (6). La penetrazione dei microrganismi all'interno della mammella avviene, generalmente, attraverso il capezzolo. In questo modo dall'esterno, essi, raggiungono il tessuto mammario e qui esplicano la loro azione patogena a carico dei tessuti ghiandolari. In allevamento, i serbatoi naturali di germi "patogeni contagiosi", quali S. aureus, sono rappresentati dai quarti mammari infetti e la diffusione del contagio avviene principalmente nella fase di mungitura. Il controllo sanitario della mastite da S. aureus, sia nella forma clinica che in quella sub-clinica, rappresenta ad oggi uno dei principali problemi sanitari irrisolti degli allevamenti di vacche da latte. Nel corso dell'ultimo decennio, si è cercato un approccio epidemiologico per la soluzione del problema (1,3,4,5) ricorrendo all'impiego della PFGE, quale strumento di elezione per lo studio della distribuzione dei ceppi di S.aureus responsabili di mastite. Da qui la necessità di allestire una banca dati, contenente i pulsotipi dei ceppi isolati, in modo da assicurare uno strumento di indagine capace di determinare e nel contempo confrontare, i profili genetici di ceppi di S. aureus isolati anche a distanza di tempo.

Campioni di latte
In un periodo di circa 18 mesi, sono stati analizzati campioni di latte bovino pervenuti al laboratorio per la ricerca di germi mastitogeni ed appartenenti a 22 diversi allevamenti situati nel territorio delle regioni Umbria, Marche e Lazio. Dai campioni di latte, prelevati dal singolo quarto mammario, sono stati isolati 32 ceppi di S. aureus, successivamente sottoposti a genotipizzazione mediante PFGE.

Isolamento di S. aureus
Per ogni campione, sono stati seminati 30 µl di latte su AS (Agar Sangue 5%) ed incubati a 37°C per 24-48 h. Da colonie di sospetti stafilococchi, sono state eseguite delle sub-colture su TSA (Triptose Soy Agar, Oxoid, Milano) incubate a 37°C per 24-48 h. Le colture così ottenute sono state sottoposte alle prove di identificazione biochimica e morfologica (Gram, catalasi, coagulasi, Voges-Prouskauser, API ID 32 Staf) ed identificate come S. aureus. (Protocollo del National Mastitis Council modificato) (10).

Preparazione dei campioni per la PFGE
Dopo aver centrifugato 150 ?l di brodocoltura di ogni ceppo (18.000 g per 1'), al pellet ottenuto sono stati aggiunti 150 µl di tampone di sospensione (10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl), 2 µl di Lisostafina (Sigma no.L-7386) e 150 µl LMP (Low Melting Point) agarosio al 2,0%. Negli appositi stampi sono stati distribuiti 100 ?l di sospensione e i blocchetti ottenuti, solidificati, sono stati incubati a 37°C per 1 h. con 500 µl di tampone di lisi (10 mM Tris HCl, 0,2% deoxycolato, 0,5% Sarkosyl) Il tampone di lisi è stato sostituito da 500 µl di PK tampone (proteinasi K)(invitrogen), PK (50 ?l/ml) ed i blocchetti sono stati incubati a 50°C per 30 min.. Infine sono stati aggiunti 150 µl di tampone con enzima di restrizione (REB) 1X contenente 25 U di SmaI (Promega, USA) ed incubati a 25°C per 2 h.

PFGE
Il gel di agarosio (1%) è stato preparato in 120 ml di tampone TBE 0,5% (0,89 M Tris-HCl PH8,4; 0,89 M acido borico; 0,02 M EDTA) ed è stato predisposto con un pettine da 15 pozzetti di 0,75 mm di ampiezza. Il marker di peso molecolare è stato inserito nelle linee 1,8 e 15 (lambda ladder, NO340; New England Biolabs) mentre i campioni sono stati posizionati nelle restanti 12 linee. L'elettroforesi è stata eseguita con un apparato CHEF DR-III ( BIO-RAD) usando impulsi da 5,3 a 34,9 finali, per 18 h a 6,0V/cm e 14°C in TBE 0,5X. (Fig.1) La colorazione in bromuro di etidio (0,5X) ha permesso di visualizzare al transilluminatore a raggi ultravioletti le bande dei campioni. Le immagini, acquisite con apparato fotografico sono state conservate in formato TIFF ed analizzate usando il software BioNumerics versione 4.0 (Applied-Maths, Sint-Matens-latem Belgium)(11).


Figura 1: Gel di agarosio all'1% al momento del posizionamento nella cella elettroforetica.


Risultati
La digestione del DNA batterico di 32 ceppi di S.aureus, isolati da campioni latte mastitico, con l'enzima di restrizione SmaI, ha prodotto 26 differenti profili di restrizione (pulsotipi). L'analisi mediante Bionumerics dei profili ottenuti ha permesso di evidenziare la correlazione tra i diversi isolati come riportato in figura 2. Considerando un cut-off di similarità pari al 50% è stato possibile evidenziare 6 diversi cluster, indicati con le lettere da A ad F (Tab. 1). Al cluster A appartengono 14 pulsotipi (54%), corrispondenti a 18 ceppi isolati (56%). Applicando un cut-off di similarità al 70%, si individuano 8 diversi sub-cluster numerati da A1 ad A8 che comprendono i pulsotipi corrispondenti a 13 diversi allevamenti (Fig. 2). Il maggior numero di allevamenti è incluso nel sub-cluster A3 del quale fanno parte 6 allevamenti. Negli allevamenti "a", "d", "h", "p", "r", "z" sono stati isolati almeno 2 ceppi di S. aureus in campionamenti eseguiti ad alcuni mesi di distanza nello stesso allevamento (Fig. 3).


Tabella 1: Tabella riassuntiva.


ingrandisci la figura sulle correlazioni esistenti tra i vari pulsotipi dei ceppi di S. aureus isolati da vacche da latte
Figura 2: dendrogramma: correlazioni esistenti tra i vari pulsotipi
dei ceppi di S. aureus isolati da vacche da latte. [INGRANDIRE]



Figura 3: Pulsotipi di alcuni ceppi di S. aureus isolati. In posizione 1,8,15 è stato posizionato il Marker (lambda ladder).
È evidente la corrispondenza delle bande tra i pulsotipi presenti in posizione 3 e 4, 6 e 7, 9 e 10.
Ogni coppia di pulsotipi corrisponde a due ceppi di S. aureus isolati da campioni di latte eseguiti a distanza di mesi nello stesso allevamento.


Discussione
La considerevole variabilità genetica (7) posseduta dai 32 ceppi batterici di S. aureus isolati è dimostrata dall'alto numero di pulsotipi identificati (26). Tale caratteristica è probabilmente legata anche al fatto che il numero degli allevamenti di bovine considerati, ricadono su un territorio molto vasto dove il passaggio di ceppi batterici dall'uno all'altro allevamento è poco probabile. Ciò nonostante, il 56% dei ceppi isolati può essere incluso all'interno del cluster A, mentre il sub-cluster A3, da solo, include 8 ceppi (25%) che corrispondono a 6 pulsotipi Di sicuro interesse e pertanto meritevole di ulteriori approfondimenti è il fatto che, anche a distanza di mesi, sia stato possibile isolare gli stessi pulsotipi in 6 diversi allevamenti e precisamente "a", "d", "h", "p", "r", "z". Ciò consente di avanzare due importanti affermazioni: - alcuni ceppi di S. aureus, sono capaci di persistere anche per lunghi periodi di tempo all'interno dell'allevamento, riuscendo a conservare il loro potere patogeno. Non sono interessati da modificazioni genetiche importanti, conservando una sostanziale stabilità genetica nel tempo. Ciò, in perfetta sintonia con quanto provato da molti ricercatori (5, 8, 9) che hanno isolato lo stesso pulsotipo anche a distanza di molto tempo (fino ad 8 anni) nel medesimo allevamento. - la PFGE conferma le sue caratteristiche di tecnica altamente attendibile e riproducibile (2) ed è quindi da considerare come metodo di elezione negli studi di epidemiologia molecolare. Alla luce di queste considerazioni risulterà in futuro più agevole comprendere il comportamento epidemiologico di S. aureus quale agente eziologico di mastiti e la difficoltà di riuscire ad ottenerne l'eradicazione dall'allevamento con il solo ricorso ai tradizionali piani di risanamento. Da qui nasce l'importanza dell'epidemiologia molecolare quale nuovo approccio alla soluzione del problema della mastite e dell' impiego, a tal fine, di strumenti affidabili quale la PFGE.

Conclusioni Il lavoro fin qui svolto, rappresenta un primo passo fatto per la creazione di un sistema di monitoraggio continuo degli agenti mastitogeni negli allevamenti di animali dal latte, ricadenti nel territorio di competenza dell'IZSUM e nel contempo, un sostegno alla formulazione di strategie di lotta per ridurre l'incidenza dei casi di mastite.

Bibliografia

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5. F.R. Buzzolla, L. Quelle, M.I. Gomez, M. Catalano,l. Steele-Moore, D. Berg., E. Gentilizi, G. Denamiel and D.O. Sordelli. Genotypic analysis of S.aureus from milk of dairy cows with mastitis in Argentina. Epidemiol. Infect. 2001. 126, 445-452.

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9. M. Haveri, S. Taponen, J Vuopio-Varkila, S. Salmenlinna and S. Pyorala. Bacterial Genotype Affects the Manifestation and Persistance of Bovine S. Aureus Intramammary Infection. J.of Clin. Microb., Feb. 2005, pag. 959-961.

10. http://www.nmconline.org/bulktank.htm
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