Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 49, Agosto 2008 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://www.spvet.it/arretrati/numero-49/002.html


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Italian cow's-milk cheese made with vegetable rennet: hygienic requisite and molecular characterization of autochthonous lactic micro-organisms
Caciotta vaccina a caglio vegetale: requisiti igienico-sanitari e caratterizzazione molecolare della flora lattica autoctona



Petruzzelli A., Micci E., Paolini F., Valli B., Aquilanti L., Clementi F., Tonucci F.


Summary. In the present study, a manufacture of bovine raw milk Caciotta cheese, typically manufactured in the mountainous hinterland of Pesaro-Urbino (Marche region) by using Cynara cardunculus flowers, was investigated. The aim of the study was to assess the microbial hygienic quality of this typical regional cheese and to identify the natural lactic acid bacteria population involved in its fermentation and ripening, also in view of a further definition of objective quality parameters.

La caciotta vaccina a caglio vegetale è un prodotto di “nicchia” della regione Marche. Tale formaggio, tipico della provincia di Pesaro-Urbino, deve le proprie caratteristiche di elevata digeribilità all’utilizzo di caglio vegetale naturale (fiori di Cynara cardunculus).

Il processo tradizionale di produzione prevede l’utilizzo di latte crudo vaccino senza l’impiego di colture starter. Al latte riscaldato a 37°C in caldaie in rame, viene aggiunto il caglio vegetale liquido ottenuto dalla lavorazione, in acqua tiepida (circa 15 minuti), dei petali di Cynara cardunculus (Figura 1).
Dopo circa 2 ore si procede alla rottura della cagliata, al travaso in stampi, alla pressatura manuale (rivoltamento ogni 12 ore per due giorni consecutivi) e alla salatura a secco. Il formaggio viene stagionato a temperatura ambiente per 2-3 mesi in luogo asciutto.

Nel presente lavoro si riportano i risultati di un’indagine condotta con l’obiettivo di valutare la qualità igienica di tale prodotto e di caratterizzare la flora lattica naturale responsabile del processo di maturazione al fine di valorizzarne la tipicità attraverso criteri oggettivi di valutazione.


Figura 1: Fiori di Cynara cardunculus

Materiali e metodi
Campionamento: Sono stati prelevati, in condizioni asettiche, 10 campioni a vari stadi di maturazione: latte crudo, cagliata, formaggio a 24 h, 48 h, 7 gg., 14 gg., 21 gg., 28 gg., 35 gg., 42 gg.

Attività analitica: Al fine di valutare la qualità igienica del prodotto, su ciascuna matrice prelevata è stata eseguita la numerazione dei coliformi totali e di E. coli (Coli ID ®-Biomerieux, 37°C per 24-48 h), la numerazione degli stafilococchi coagulasi positivi e Staphylococcus aureus (Baird Parker agar + RPF Supplement, 37°C per 24-48 h) utilizzando metodiche accreditate secondo la norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025. Tutti i campioni sono stati testati per Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Campylobacter termotolleranti, E. coli O157, ed enterotossina stafilococcica utilizzando l’apparecchio miniVIDAS (Biomerieux ®) con metodo ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay).
Al fine di determinare la composizione della flora lattica è stato eseguito il conteggio e l’isolamento dei lattococchi mesofili (M17 Agar, 22°C per 72 h), dei lattobacilli (MRS Agar, 37°C per 72 h in anaerobiosi) e dello S. thermophilus (M17 Agar, 42°C per 48 h).

Identificazione molecolare: Gli isolati sono stati identificati utilizzando il metodo ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) (2). La reazione di PCR è stata eseguita utilizzando primer specifici per la regione variabile V1 del gene per il 16S rRNA. L’amplificato ottenuto è stato sottoposto a digestione con 3 enzimi di restrizione: AluI, HaeIII, FokI (Figura 2).



MK: Ladder da 50bp
1: profilo di restrizione ottenuto attraverso digestione con AluI
2: profilo di restrizione ottenuto attraverso digestione con HaeIII
3: profilo di restrizione ottenuto attraverso digestione con FokI

Figura 2: profili di restrizione di alcuni stipiti di batteri lattici isolati


Dal confronto dei pattern ottenuti con quelli di ceppi di riferimento di Collezioni di Colture ufficiali (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikrorganismen und Zellkulturen; ATCC-American Type Culture Collection; NCIMB-National Collections of Industrial and Marine Bacteria; NRRL-Northern Regional Research Laboratory ARS Culture Collection), è stato possibile attribuire l’appartenenza degli isolati a diversi generi e specie batteriche.

Risultati
Tutti i campioni analizzati sono risultati negativi per Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Campylobacter termotolleranti, E. coli O157, enterotossina stafilococcica.
Le conte dei coliformi totali, di E. coli, degli stafilococchi coagulasi positivi e di Staphylococcus aureus sono riportate nel grafico1.

La microflora lattica raggiunge un picco massimo di crescita a 24 ore passando da valori iniziali di 102 ufc/g a valori compresi tra 109-1010 ufc/g; nelle fasi successive si evidenzia un decremento, seguito, a partire dal 14 giorno fino a fine maturazione, da una stabilizzazione su valori compresi tra 106-107 ufc/g (Grafico 2).

Dall’analisi molecolare si evidenzia che la comunità di batteri lattici è dominata da 4 diversi gruppi: Enterococcus spp., Lactobacillus paraplantarum, Lb. plantarum group e Lb. buchneri. Con frequenze minori sono state riscontrate le specie Lb. gasseri e Lb. farciminis (Grafico 3).





Grafico 1: Numerazione germi indice di contaminazione





Grafico 2: Flora lattica naturale




Grafico 3: Generi e specie batteriche appartenenti alla flora lattica naturale


Discussione
I risultati relativi alla ricerca di germi patogeni evidenziano il rispetto dei requisiti sanitari del prodotto analizzato. Le numerazioni dei germi indice di contaminazione raggiungono valori abbastanza elevati (105-106 ufc/g) nelle prime fasi di processo (24h - 48h) fino a 14 giorni di maturazione probabilmente a causa della lavorazione artigianale e dell’utilizzo di caglio vegetale naturale non sottoposto a trattamento termico.
Tuttavia, tale contaminazione subisce, nelle fasi successive, una progressiva riduzione fino al completo annullamento a 35 giorni di stagionatura.

L’andamento delle curve di crescita della microflora lattica, nelle fasi seguenti alle 48h, risulta essere in accordo con quanto riportato da altri autori (3) (4) sulla composizione microbiologica di formaggi italiani a latte crudo vaccino; l’elevato incremento che si evidenzia nelle fasi iniziali (latte - 24 h) potrebbe essere associato alla presenza di batteri lattici sulle foglie e sul fiore del coagulante vegetale (Cynara cardunculus) utilizzato (5).

Dallo studio molecolare della flora funzionale emerge, in accordo con quanto riportato da altri autori in studi su formaggi a latte crudo (6), una predominanza costante del genere Enterococcus in tutte le fasi di processo.
La presenza e la permanenza di tali germi, nel corso della stagionatura, potrebbe essere associata ad una contaminazione fecale durante il processo di lavorazione e alla capacità di tali microrganismi di crescere ad elevate concentrazioni saline, ad alte temperature e bassi valori di pH (6) (7).

Le specie ascritte al gruppo Lb. plantarum risultano essere dominanti e caratterizzanti il prodotto, sia nelle fasi iniziali sia in quelle finali del processo; tali specie, oltre ad avere attività antimicrobica, sono note per il loro significativo contributo nella definizione delle proprietà organolettiche del formaggio (8).

Nelle fasi centrali di processo (7 gg - 14 gg) si ha una predominanza della specie Lb. buchneri, un microrganismo alterativo fortemente proteolitico, noto per la potenziale produzione di amine biogene attraverso la decarbossilazione di aminoacidi, quali istamina e fenilalanina (9). La presenza di questa specie, almeno nelle fasi iniziali del processo fermentativo, potrebbe spiegare il caratteristico sapore amaro del formaggio in studio, in quanto è noto che una eccessiva proteolisi può condurre alla produzione di peptidi amari (10).

Per avere una conferma dell’identità di specie degli isolati ottenuti sarebbe opportuno procedere al sequenziamento del gene codificante il16S rRNA di alcuni rappresentati dei gruppi identificati.

Bibliografia

  1. Sofia V. Silva, F. Xavier Malcata. 2005. Studies pertaining to coagulant and proteolytic activities of plant proteases from Cynara cardunculus. Food Chemistry 89, 19–26.

  2. Aquilanti L., Silvestri G., Zannini E., Osimani A., Santarelli S., Clementi F. 2007. Phenotypic, genotypic and technological characterization of predominant lactic acid bacteria in Pecorino cheese from Central Italy. Journal of Applied Microbiology, doi:10.1111/j.1365-2672.2007.03513.x.

  3. Andrighetto C., Valier l., Roncaglia B., Cattelan A., Lombardi A. 2004. Studio della microflora lattice autoctona del formaggio “Spressa delle Giudicarie”. Industrie Alimentari, 148-154.

  4. Fazzino S., Randazzo CL., Torriani S. 2002. Evoluzione e caratterizzazione della microflora lattica autoctona del formaggio Ragusano. Industrie Alimentari, 290-294.

  5. Rodas AM, Ferrer S., Pardo I. 2003. 16S-ARDRA, a Tool for Identification of Lactic Acid Bacteria Isolated from Grape Must and wine. Systematic and Applied Microbiology, 26, Issue 3: 412-422.

  6. Giraffa G. 2003. Functionality of enterococci in dairy products. Int j Food Microbiol. 88, 215-222.

  7. Gelsomino R., Vancanneyt M., Condon S., Swings J. and Cogan TM. (2001) Enterococcal diversity in the environment of an Irish Cheddar-type cheesemaking factory. Int j Food Microbiol. 71, 177-188.

  8. Katina K., Heiniö RL., Autio K and Poutanen K. 2006. Optimization of sourdough process for improved sensory profile and texture of wheat bread LWT - Food Science and Technology,  39, Issue 10: 1189-1202.

  9. Leuschner RG, Kurihara R, Hammes WP. 1998. Effect of enhanced proteolysis on formation of biogenic amines by lactobacilli during Gouda cheese ripening. Int. J. Food Microbiol. 44(1-2):15-20.

  10. Saha BC, Hayashi K. 2001. Debittering of protein hydrolyzates. Biotechnol Adv. 19(5):355-70.

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Caciotta vaccina a caglio vegetale: requisiti igienico-sanitari e caratterizzazione molecolare della flora lattica autoctona. by Petruzzelli A., Micci E., Paolini F., Valli B., Aquilanti L., Clementi F., Tonucci F. is licensed under a Creative Commons Attribuzione 2.5 Italia License. Based on a work at spvet.it. Permissions beyond the scope of this license may be available at http://indice.spvet.it/.