Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 46, Febbraio 2008 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/arretrati/numero-46/001.html

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SOPRAVVIVENZA DI LISTERIA MONOCYTOGENES E SALMONELLA TYPHIMURIUM IN "SALAME PERUGINO" ADDIZIONATO DI LAB PRODUTTORI DI BATTERIOCINE E CONTAMINATO SPERIMENTALMENTE

Cibotti S., Scuota S., Bazzucchi V., Bonanno S., Tommasino M., Valiani A., Morgante A. R., Sebastiani C., Cenci T.


Abstract. The traditional salumi salami and preserved pork product of Umbria Region (Italy) has a great gastronomic and cultural value. The purpose of the present work is to monitoring the survival and growth of Listeria monocytogenes and Salmonella Typhimurium in experimentally inoculated salami to which manufacturing LAB of bacteriocin (isolated by typical Umbria pork product) was added. In this case, safety and maintenance are based on a technology based on the combination of several factors such as: temperature, pH, aw, along with new techniques of maintenance (gas packaging, biopreservation, microorganisms bacteriocin starter producers, high pressure pastorization treatments). That to the purpose of creating selective factors (obstacles) able of inhibiting the development of the pathogen microorganisms. Results have shown that the lactic bacteria bacteriocin producers may represent an useful instrument in the manufacturing of the traditional pork products, helping to guarantee hygienic-sanitary requisites.


Introduzione
I salumi tradizionali umbri appartengono a quei prodotti "di nicchia" di alto valore gastronomico e culturale e rappresentano un vero patrimonio da salvaguardare e custodire. Se da un lato è quindi importante mantenere, anche nelle produzioni industriali, le caratteristiche che consentono al prodotto di essere definito tradizionale, dall'altro è fondamentale garantirne i parametri igienico sanitari.
La sicurezza e la conservazione dei salumi è basata su una tecnologia che prevede la combinazione di parametri quali temperatura, pH, aw, con nuove tecniche di conservazione (gas packaging, bioconservazione, starter produttori di batteriocine, trattamenti di pastorizzazione ad alta pressione), allo scopo di creare fattori selettivi (ostacoli) capaci di inibire lo sviluppo dei microrganismi patogeni (5, 6).

Nell'ultimo decennio si è definito un nuovo approccio alla stabilizzazione degli alimenti, chiamato bioprotezione, che si basa sull'antagonismo dimostrato da alcuni microrganismi nei confronti di altri; in particolare i batteri lattici (LAB) rappresentano un gruppo di microrganismi che può svolgere un ruolo protettivo contrastando lo sviluppo di microrganismi patogeni.
I LAB, infatti, sono spesso utilizzati come colture starter nei prodotti a base di carne fermentati, in quanto, oltre a determinare (insieme ad altre famiglie di batteri) il flavour del prodotto, hanno un importante effetto protettivo, che si riflette anche in un prolungamento della shelf life. La fermentazione dei carboidrati presenti nella materia prima determina un abbassamento del pH in seguito alla produzione di acido lattico che disturba l'omeostasi del microrganismo patogeno e quindi la sua sopravvivenza. Inoltre l'interferenza microbiologica dei batteri lattici può essere legata alla produzione di batteriocine, sostanze di natura proteica che svolgono un importante ruolo nel controllo di microrganismi indesiderati (7).
La presenza di batteri patogeni quali Listeria monocytogenes e Salmonella spp. nell'impasto di salami è relativamente frequente: può essere dovuta all'utilizzo di una materia prima già contaminata o a contaminazioni durante il processo produttivo. E' quindi fondamentale utilizzare colture starter che possano minimizzare il rischio di sviluppo di questi patogeni, mantenendo nel contempo le caratteristiche di tipicità del prodotto.
Scopo del presente lavoro è stato quello di monitorare la sopravvivenza e l'andamento di Listeria monocytogenes e Salmonella Typhimurium in salami inoculati sperimentalmente e addizionati di LAB produttori di batteriocine e non, isolati da salumi tipici umbri.

Materiali e metodi
Ceppi patogeni: sono stati utilizzati un ceppo di Listeria monocytogenes e uno di Salmonella Typhimurium isolati da salumi tipici umbri, ad un livello di inoculo di 104 UFC/g. Entrambi i ceppi sono stati adattati alle basse temperature della cella di stagionatura, mediante ripetuti passaggi in BHI a 12°C per 48h.
Batteri lattici: in uno studio preliminare (3) si era provveduto dapprima ad isolare e tipizzare i ceppi di batteri lattici autoctoni e successivamente ad effettuare delle prove in vitro (8) per verificare la produzione di batteriocine nei confronti dei patogeni isolati dagli stessi salumi; erano stati scelti 3 ceppi di LAB che avevano dimostrato attività antibatterica nei confronti di Listeria monocytogenes e Salmonella Typhimurium. I tre ceppi batterici erano stati sottoposti all'amplificazione di una porzione del 16S r-RNA (13) e i tre amplificati, dopo purificazione con "High pure PCR product purification kit" (Roche), erano stati sequenziati tramite sequenziatore automatico ABI PRISM 310® Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ed erano risultati appartenere tutti e tre alla specie Lactobacillus sakei subsp. sakei. I tre ceppi, opportunamente miscelati sono stati utilizzati come starter in una produzione di salami per verificare che non inducessero variazioni sostanziali dei caratteri organolettici del prodotto.
Nella presente sperimentazione ognuno dei tre ceppi batterici è stato rivitalizzato e coltivato a 37°C per 48h in brodo MRS (OXOID-CM0359) tamponato a pH 6.8.
Le tre brodocolture così ottenute sono state opportunamente miscelate; la brodocoltura "finale" è stata centrifugata a 3000 rpm per 30' e il pellet risospeso in un volume finale di 50 mL di brodo MRS tamponato, che è stato incubato per 4 ore a 37°C prima di inocularlo nei salami alla concentrazione di 10 6 UFC/g.

Dagli stessi salumi erano stati inoltre selezionati 3 ceppi di LAB che alle prove in vitro non avevano dimostrato attività antibatterica. Questi ultimi sono stati sottoposti alla medesima procedura di preparazione. Produzione dei salami: la preparazione e la stagionatura dei salami sono state effettuate seguendo la tecnologia produttiva utilizzata da un salumificio operante nella Regione, che ha fornito anche la carne macinata utilizzata per i salami, il condimento a base di NaCl e di spezie. Non sono stati addizionati nitrati e nitriti per evitare eventuali interferenze con l'andamento dei patogeni e dei batteri lattici inoculati nei salumi.
Sono stati preparati due lotti di salami, contaminati rispettivamente con Listeria monocytogenes e con Salmonella Typhimurium; ogni lotto era costituito da 15 pezzi (di circa 1 Kg), di cui 5 inoculati solamente con il patogeno (A), 5 con il patogeno e i LAB produttori di batteriocine (B), 5 con il patogeno e i LAB non produttori di batteriocine (C).
Stagionatura: il processo di stagionatura è stato effettuato impostando la cella secondo le indicazioni fornite dal salumificio. Campionamento e analisi microbiologiche: un'aliquota dell'impasto di partenza è stata sottoposta a ricerca di Salmonella spp. (1), di Listeria monocytogenes (2) e alla numerazione di Stafilococchi coagulasi positivi (11). I prelievi sui salami sono stati effettuati, con cadenza prestabilita, al tempo 0, al 4°, 7°, 14°, 28° e 58° giorno di stagionatura.
Ad ogni prelievo sono state effettuate sui salami prodotti la determinazione dell'Aw e del pH, la numerazione di Listeria monocytogenes o di Salmonella Typhimurium e la numerazione di Lattobacilli.
La numerazione di Listeria monocytogenes è stata eseguita secondo la Norma UNI EN ISO 11290-2:2005 (10); la numerazione di Salmonella Typhimurium è stata eseguita mediante conteggio diretto su piastre di terreno cromogenico (BIORAD) incubato 24 ore a 37°C; la numerazione dei lattobacilli è stata eseguita mediante conteggio su MRS agar (OXOID - CM0361) incubato a 37°C per 48 ore in anaerobiosi. Al 4° e al 58° giorno sono stati identificati tramite sequenziamento 10 ceppi di LAB isolati su MRS agar, al fine di valutare come si evolvesse la popolazione lattica nel corso della stagionatura.

Risultati
L'impasto di partenza è risultato negativo per la presenza di Listeria monocytogenes e Salmonella spp; gli Stafilococchi coagulasi positivi sono risultati inferiori a 10 UFC/g. I dati relativi all'andamento delle variabili Aw e pH ai vari tempi di stagionatura sono riportati nelle tabelle 1 e 2. In entrambi i lotti l'aW è scesa durante tutto il periodo della stagionatura fino a valori di 0.83 al 58°giorno dalla produzione; il pH, durante la stufatura, ha subito un rapido decremento, cui ha fatto seguito un lieve innalzamento nelle fasi successive di stagionatura: tale deacidificazione probabilmente è dovuta alla attività delle Micrococcaceae e di alcuni Streptococchi fecali (4).

Tab. 1 - Salami contaminati con L. monocytogenes
  Aw pH
  A B C A B C
0 0.97 0.96 0.97 5.83 5.70 5.75
4 gg0.95 0.96 0.96 4.83 4.82 4.80
7 gg 0.94 0.95 0.94 4.66 4.73 4.78
14 gg 0.92 0.92 0.92 4.75 4.82 4.84
28 gg 0.89 0.90 0.89 5.00 4.68 4.86
58 gg 0.83 0.83 0.83 5.12 4.92 4.92


Tab. 2 - Salami contaminati con S. typhimurium
  Aw pH
  A B C A B C
0 0.97 0.97 0.97 5.79 5.75 5.78
4 gg 0.96 0.96 0.96 4.65 4.86 4.84
7 gg 0.94 0.94 0.94 4.67 4.76 4.73
14 gg 0.93 0.93 0.93 4.66 4.73 4.70
28 gg 0.89 0.89 0.89 4.87 4.82 4.85
58 gg 0.83 0.83 0.83 4.99 4.87 4.88


Nei Grafici 1 e 2 è mostrato l'andamento dei lattobacilli, di Listeria monocytogenes e di Salmonella Typhimurium durante la stagionatura dei due lotti di salami.
Nella serie A si osserva un andamento crescente del numero di LAB, che nei primi 4 giorni di stagionatura passa da 3,5 log a oltre 8 log e tende poi a mantenersi stabile. Per quello che riguarda le serie B e C, l'iniziale numero di 6 log raggiunge un valore di oltre 8 log al 4°giorno per poi stabilizzarsi.
Dei dieci ceppi di LAB reisolati al 4° giorno di stagionatura, sono stati identificati come Lactobacillus sakei subsp. sakei otto ceppi, sei dei quali hanno dato sequenze sovrapponibili a quelle dei ceppi utilizzati come miscela starter. Dei dieci ceppi di LAB isolati al 58° giorno, sono stati identificati come Lactobacillus sakei subsp. sakei soltanto due ceppi.





Dal grafico 1 si può notare come, al 4° giorno, nella serie di salami contaminati col solo patogeno (A) si determina un aumento di circa un log di L. monocytogenes, che tende poi a mantenersi invariata durante la stagionatura. Una situazione del tutto paragonabile si verifica per la serie di salami contenenti il patogeno e i batteri lattici non produttori di batteriocine (C).
Nella serie di salami contaminati con il patogeno e i batteri lattici produttori di batteriocine (B) non si osserva tale incremento al 4°gg di stagionatura, ma la quantità di Listeria presente rimane pressoché invariata rispetto all'inoculo per tutto il periodo della stagionatura.
Il comportamento di Listeria della serie B può essere correlato all'azione antibatterica svolta dai ceppi di LAB produttori di batteriocine.

Nel secondo lotto il numero di LAB nella serie A raggiunge il valore osservato nei salami del lotto 1 intorno al 7° giorno e poi si stabilizza. Nelle serie B e C l'andamento è analogo a quello osservato nelle corrispondenti serie del lotto 1.

Dal grafico 2 si può notare come, al 4° giorno, nella serie di salami contaminati col solo patogeno (A), si determina un lieve aumento di S. Typhimurium, che non si osserva invece nelle altre 2 serie; successivamente nelle serie A e C si osserva un costante e graduale decremento fino ad arrivare a valori di 2 log a fine stagionatura. Nella serie di salami contaminati con S. Typhimurium e i LAB produttori di batteriocine (B), tale decremento appare più marcato e a fine stagionatura il patogeno non è più isolabile. Il decremento di Salmonella Typhimurium è tuttavia verosimilmente influenzato anche dai parametri chimico fisici; anche nelle serie B e C, infatti si osserva una diminuzione di circa 3 log.

Conclusioni
Il diverso comportamento osservato per i due patogeni può essere ascritto a diversi fattori. Salmonella spp. si riduce fisiologicamente a causa delle condizioni chimico fisiche che si vengono a creare durante la stagionatura; l'aggiunta di LAB produttori di batteriocine sembra comunque potenziare tale decremento fino alla inattivazione del germe a fine stagionatura. Nel caso di L. monocytogenes, il fatto che essa rimanga sostanzialmente stabile durante tutta la stagionatura può essere legato a diversi fattori: innanzitutto il livello di inoculo utilizzato, volutamente alto per meglio apprezzare eventuali variazioni; come evidenziato dai risultati dei sequenziamenti effettuati sui LAB, al 4° giorno la percentuale di Lactobacillus sakei subsp. sakei è ancora molto alta e questo può inibire lo sviluppo del germe, cosa che non è invece avvenuta nei salami delle serie A e C, non contenenti LAB produttori di batteriocine aggiunti. La flora lattica precipua, naturalmente presente nelle materie prime e nell'ambiente, nel corso della stagionatura prende il sopravvento sulle colture starter di LAB produttori di batteriocine. Lactobacillus sakei subsp. sakei tende infatti a diminuire nel corso della stagionatura, tanto che al 56°giorno solo due ceppi su 10 sono risultati tali, per cui è plausibile ipotizzare che, man mano che procede la stagionatura, le batteriocine prodotte non siano sufficienti a determinare la riduzione del patogeno.
Inoltre il ceppo di Listeria monocytogenes utilizzato per la prova è stato isolato dalla stessa matrice; è quindi adattato alle condizioni utilizzate, rispetto a ceppi di Listeria monocytogenes di campo, e questo determina una modesta riduzione della carica, come dimostrato da altri Autori (9). L'aumento della concentrazione di sale che si verifica nel corso della stagionatura può inoltre compromettere severamente la produzione di alcune classi di batteriocine (12), senza contare che la batteriocina eventualmente prodotta può perdere la sua efficacia, legandosi ad alcune componenti della matrice alimentare o subendo una degradazione proteolitica che ne impedisce l'attività antibatterica.
I risultati complessivi della sperimentazione inducono a ritenere che i batteri lattici produttori di batteriocine possono rappresentare un utile strumento nella produzione dei prodotti tradizionali, contribuendo a garantirne i requisiti igienico-sanitari.

Bibliografia

1. AFNOR BIO 12/16-09/05: Attestation de validation de méthode alternative VIDAS Easy Salmonella

2. AFNOR BIO 12/11-03/04: Attestation de validation de méthode alternative VIDAS Listeria monocytogenes 2 avec étape d'enrichissment à 37°C.

3. Cibotti S., Tommasino M., Cenci T., Scuota S. 2006. Definizione della microflora nei salumi tradizionali umbri: nota preliminare. Atti XIII Conferenza Nazionale "La sicurezza microbiologica nella produzione di alimenti per il 21° secolo" - Bologna, 11 maggio 2006. Pag. 117.

4. http:www.inea.it/ssa/sitopoma19/Ipertesto/Stato %20Arte.htmliarticolo inea.

5. Hugas M. 1998. Batteriocinogenic lactic acid bacteria for the biopreservation of meat and meat products. Meat science 49, S139-S150.

6. Leistner L., Gorris L.G.M. 1995. Food preservation by hurdle technology. Trends in Food Science and Technology, 6, 41-46.

7. Schillinger U., Geisen R. and Holzapfel W.H. 1996. Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods. Trends in Food Science & Technology. 7(5), 158-164.

8. Teixeira de Carvalho A.A., Aparecida de Paula R.,. Mantovani H.C. and Alencar de Moraes C. 2006. Inhibition of Listeria monocytogenes by a lactic acid bacterium isolated from Italian salami. Food Microbiology, 23 (3), 213-219.

9. Thévenot D., Delignette-Muller M.L., Christieans S., Vernozy-Rozand C. 2005. Fate of Listeria monocytogenes in experimentally contaminated French sausages. Int. Journal of Food Microbiology. 101, 189-200.

10. UNI EN ISO 11290-2:2005: Metodo orizzontale per la ricerca e la conta di Listeria monocytogenes- Parte 2 : Metodo per la Conta.

11. UNI EN ISO 6888-2: Metodo orizzontale per la conta di stafilococchi coagulasi-positivi (terreno agar al plasma di coniglio e fibrinogeno).

12. Urso R., Rantsiou K., Cantoni C., Comi G. and Cocolin L. 2006. Technological characterization of a bacteriocin-producing Lactobacillus sakei and its use in fermented sausages production. International Journal of Food Microbiology. 110(3), 232-239.

13. Young,J.P.W., Douwner,H.L. and Eardly, B.D. (1991).1991 Phylogeny of the phototrophic Rhizobium strain BTAi1 by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S r-RNA gene segment. J Bacteriol 173:2271-2277.