Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 32, novembre 2005 [http://spvet.it]Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/indice.html#301
Molecular methods to discriminate BSE from Scrapie.
Metodi molecolari per la distinzione fra BSE e Scrapie
Chiasserini D.
Abstract: The discovery of the first case of Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in a goat in January of 2005 has underlined the impelling necessity of a rapid test that allow the distinction between BSE and scrapie, the sheep encephalopathy that is not transmissible to man. The European Commission after two year testing period has established the modifications to the Rule 999/ 2001, pointing out the new rules for distinction between scrapie and BSE. Moreover it has been introduced a series of methodologies based on immunoassays and western blotting in order to distinguish scrapie from BSE on two factors: the differences in molecular weight and in the glycosilation of prion protein. In this review we furnish a survey on existing techniques to differentiate scrapie from BSE and the description of the necessary steps to the recognition of a BSE case in sheeps and goats.
Riassunto: La scoperta del primo caso di Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in una capra a gennaio del 2005 ha evidenziato l'impellente necessità di un test rapido che possa permettere la distinzione tra la BSE e la scrapie, l'encefalopatia degli ovini che al contrario di quella bovina non è trasmissibile all'uomo. La Commissione Europea dopo un periodo di test di alcuni anni ha stabilito le modifiche al regolamento 999/2001, indicando le nuove modalità di distinzione tra scrapie e BSE. Sono state individuate una serie di metodologie basate su saggi immunologici e western blotting che permettono di distinguere la scrapie dalla BSE in base a due fattori: le differenze nel peso molecolare e nella glicosilazione della proteina prionica. In questa review si intende fornire una panoramica sulle tecniche molecolari esistenti per differenziare le TSE ovine dalla BSE e la descrizione dei passaggi necessari al riconoscimento di un caso di BSE negli ovini.
Introduzione
Il 28 gennaio 2005 la Commissione Europea ha confermato, dopo un periodo di test di due anni, il primo vero caso di encefalopatia spongiforme bovina (BSE) naturale in un ovi-caprino, una capra macellata in Francia nel 2002 (Eloit M. et al., 2005).
Questa scoperta pone l'accento sulla possibilità che l'agente infettivo della BSE bovina possa passare ai piccoli ruminanti. Già da alcuni anni la Commissione Europea ha stabilito rigidi controlli per impedire la diffusione delle Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSE) negli ovi-caprini. Questa possibilità ha inoltre imposto la necessità di sviluppare al più presto un test rapido ed affidabile per la distinzione tra BSE e scrapie.
Il 12 gennaio 2005 modificando il regolamento 999/2001 la Commissione Europea ha stabilito le nuove norme per la sorveglianza epidemiologica delle TSE negli ovi-caprini, codificando i vari passaggi necessari per il riconoscimento della BSE in questa categoria di animali.
Gli studi di seguito citati sono stati reperiti tramite Basi di dati quali PubMed, ASFA, Medline, con accesso tramite interfaccia OvidTM, ScienceDirectTM. Sono stati utilizzati motori di ricerca scientifici quali Scirus (http://www.scirus.com) e Google Scholar (http://scholar.google.com), oltre che pubblicazioni nella BBS dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche (http://www.izsum.it).
TSE: caratteristiche molecolari delle proteine prioniche
Le Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili sono malattie neurodegenerative causate dall'accumulo di una forma anomala della proteina cellulare PrPC, denominata PrPSc. La struttura delle due proteine è identica dal punto di vista della sequenza aminoacidica, ma è sostanzialmente differente per la struttura tridimensionale.
La diversità nella struttura tridimensionale provoca l'acquisizione di proprietà particolari da parte della PrPSc. La forma anomala presenta, infatti, una ridotta solubilità e una marcata resistenza alla proteolisi. Sottoponendo la PrPSc ad idrolisi enzimatica con proteinasi K essa risulta parzialmente resistente, lasciando un core non idrolizzabile di peso molecolare intorno a 27-30 kDa (Oesch B. et al., 1985).
L'analisi della struttura tridimensionale ha inoltre evidenziato, dal punto di vista della struttura secondaria, un alto contenuto nella forma normale di alfa-eliche, mentre, dopo il cambiamento conformazionale che porta alla formazione di PrPSc, diventano prevalenti i beta-sheets (Pan K. et al., 1993). La resistenza parziale alla digestione enzimatica interessa il frammento C-terminale, infatti, viene idrolizzato solamente l'N-terminale con un taglio intorno agli aminoacidi 80-100.
Il frammento C-terminale è così evidenziabile mediante elettroforesi e seguente Western Blotting. Questo frammento contiene i siti di glicosilazione e con le metodiche sopracitate dà luogo a tre bande, con differente peso molecolare. Quella a più elevato peso molecolare presenta due glicosilazioni, quella intermedia una sola glicosilazione, mentre quella non glicosilata, si posiziona nel western blotting in posizione a più basso peso molecolare.
Distinzione dei ceppi di TSE
Studi iniziati in Inghilterra a partire dagli anni '70 (Dickinson A. et al., 1968) e continuati negli anni '90 (Bruce M.E. et al., 1991, Bruce M. et al., 1994) hanno evidenziato come all'interno della stessa patologia neurodegenerativa, in particolare la scrapie, fosse possibile distinguere, mediante prova biologica in topi, diversi ceppi della stessa TSE.
I parametri presi in considerazione nella tipizzazione biologica sono il tempo di incubazione della patologia in diversi ceppi murini ed il tipo di lesioni cerebrali. Diversi ceppi di scrapie presentano, infatti, un tipico "profilo di lesione" a livello cerebrale caratterizzato dalla vacuolizzazione neuronale di specifiche aree cerebrali. È stato visto inoltre che attraverso queste tecniche era possibile anche differenziare la BSE dalla scrapie negli ovini (Fraser H. et al., 1992; Bruce M.E. et al., 2002).
Se sottoposto a tipizzazione su topi, l'agente infettivo tipico della BSE presenta una marcata uniformità per quanto riguarda il profilo di lesione, uniformità che mantiene anche dopo vari passaggi in topi diversi.
Questo ha permesso di ipotizzare l'esistenza inizialmente di un solo ceppo di BSE, mentre la scrapie, nella tipizzazione, manifesta l'esistenza di diversi ceppi.
Recentemente, però, il gruppo del Centro di Referenza Nazionale di Torino (Casalone C. et al., 2004) ha scoperto un secondo ceppo di BSE, che hanno denominato Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy (BASE).
Questa tipologia di metodi di distinzione è tutt'ora adottata come prova finale per la differenziazione tra scrapie e BSE. Essa risulta però estremamente costosa e time-consuming; da qui l'interesse per lo studio di metodi di differenziazione molecolare e biochimica che potrebbero garantire sia l'economicità, sia l'applicabilità alla routine diagnostica.
Lo studio dei pattern molecolari di glicosilazione dei ceppi di TSE, ottenuti dopo digestione enzimatica, è iniziato a partire dagli anni '90.
È stato dimostrato, infatti, che le pecore infettate sperimentalmente con la BSE, presentavano una PrPSc che, dopo digestione con proteinasi K, ha un peso molecolare inferiore a quello dei casi di scrapie naturale (Hill A.F. et al., 1998). La scoperta è poi stata estesa anche al confronto con la scrapie naturale di altri paesi Europei, quali l'Inghilterra (Hope J. et al., 1999), la Francia (Baron T.G. et al., 2000), l'Irlanda (Sweeney T. et al., 2000) e l'Italia (Nonno R. et al.,2003).
In tutti questi casi la differenza tra la BSE ovina e lo scrapie è rappresentata dal peso molecolare della forma non glicosilata del frammento C-terminale e dal differente rapporto quantitativo tra le due forme glicosilate.
Nella BSE ovina la forma non glicosilata presenta un peso molecolare inferiore di circa 1 kDa rispetto ai casi di scrapie, inoltre il rapporto tra la forma diglicosilata e quella monoglicosilata risulta maggiore.
Purtroppo, da un punto di vista analitico, la sola differenza di peso molecolare non sarebbe stata utile allo scopo di sviluppare un test diagnostico su larga scala, poiché comporta la necessità di misurare piccole differenze di carattere quantitativo.
Un significativo passo avanti è stato fatto nel 2002, quando utilizzando metodiche di Western Blotting, è stata ottenuta una valutazione più qualitativa delle due malattie (Stack M.J. et al., 2002). Questa metodica, messa a punto presso il Veterinary Laboratories Agency (VLA) in Inghilterra da Micheal J. Stack, prevede l'utilizzo di due anticorpi monoclonali, il P4 e il 6H4. Il P4 si lega ad un epitopo N-terminale della PrP, che è vicino al sito di taglio della proteinasi K, mentre il 6H4 riconosce un epitopo C-terminale, risparmiato dalla digestione enzimatica. In particolare il legame dell'anticorpo P4 è molto discriminante, perché nei casi di BSE bovina e BSE ovina sperimentale risulta molto diminuito.
Le differenze sopra discusse potrebbero dipendere dalle differenze conformazionali tra la proteina PrPSc, derivata dalla BSE, e la proteina PrPSc derivata dalla scrapie. Queste potrebbero subire un differente processo di proteolisi, portando sia alla differenza nel peso molecolare, sia probabilmente spiegando il ridotto legame dell'anticorpo P4. Nel caso della PrPSc derivata dalla scrapie sia l'epitopo N-terminale che quello C-terminale rimarrebbero inalterati dopo digestione con proteinasi K, mentre nel caso della BSE il sito di taglio risulterebbe o dentro l'epitopo N-terminale oppure spostato più verso il C-terminale della molecola, causando il mancato riconoscimento della proteina da parte dell'anticorpo P4.
La difficoltà di sviluppare un test rapido è stata inoltre aumentata dalla scoperta delle particolari proprietà di un ceppo sperimentale di scrapie, descritto per la prima volta nel 1988, il CH1641.(Foster J.D. and Dickinson A.G., 1988).
Esso presenta un profilo biochimico simile alla BSE, con un peso molecolare della forma non glicosilata simile a quello della BSE ovina. (Hope J. et al., 1999). Tali caratteristiche rendono difficile la distinzione tra la BSE ed il ceppo CH1641 con il test discriminante sopra descrittto, anche se è possibile evidenziare un minor grado di glicosilazione della PrPSc del CH1641 rispetto alla BSE (Stack M.J. et al., 2002). Inoltre non è nota la frequenza di isolati di scrapie naturale con caratteristiche molecolari simili al CH1641.
Altre metodiche di analisi sviluppate in Francia, prevedono l'utilizzo di test ELISA appositamente designati (Lezmi S. et al., 2004).
In questa tecnica vengono utilizzati due anticorpi, quello immobilizzato, che riconosce un epitopo N-terminale, mentre quello tracciante si lega al C-terminale.
Il test è formalmente derivato dal test diagnostico Biorad per la BSE, quest'ultimo viene effettuato in un tampone controllato, per cui durante la digestione tramite proteinasi K l'estremità N-terminale viene preservata dalla proteolisi, perché protetta dall'anticorpo. Il gruppo di ricerca francese ha modificato alcuni parametri del test Biorad, variando gli anticorpi e il tampone di digestione in modo che questa volta l'epitopo N-terminale venga digerito preferibilmente nella BSE ovina, ma si preservi nello scrapie. Misurando il rapporto tra il segnale dell'anticorpo dato dal set di campioni dopo digestione con il classico test Biorad ed il segnale dato dal test modificato è stato ottenuto un valore discriminante per distinguere scrapie e BSE.
Sono stati studiati anche metodi immunoistochimici (Jeffrey M. et al., 2001). Tramite anticorpi marcati è stato possibile distinguere a livello del sistema nervoso centrale e del sistema linforeticolare, un differente pattern di marcatura tra la BSE di origine bovina e quella ovina. Le differenze esistono sia nella intensità della marcatura sia nella localizzazione cellulare e neuroanatomica della stessa, indice di una diversa distribuzione della proteina PrPSc. Il metodo è però piuttosto laborioso ed è stato ritenuto di difficile applicabilità per la routine diagnostica e verrà probabilmente usato insieme ad altri test, per fornire conferme successive.
Modifiche legislative europee in merito alla distinzione tra scrapie e BSE.
In seguito al parere dello Scientific Steering Committee della Commissione Europea fornito nel 2002 e al perdurare delle preoccupazioni riguardo al rischio di trasmissione della BSE agli ovini è stata affrontata, a livello europeo, la questione della distinzione tra scrapie e BSE negli ovini.
La Commissione Europea ha demandato ad un gruppo di esperti, coordinato dal VLA e denominato poi Strain Typing Expert Group (STEG) di selezionare e validare le metodiche in grado di effettuare la distinzione molecolare e renderle disponibili per i centri di referenza di ogni stato membro.
Da questo lavoro, durato oltre due anni, sono state approvate per la discriminazione scrapie/BSE sei Western Blot discriminatori, che hanno come principio fondante la metodica di Stack. Una, basata sul western blotting della Prionics, è stata sviluppata dal VLA in Inghilterra, due sono francesi (Lezmi S. et al, 2004), una è stata sviluppata presso il centro di referenza tedesco da M. Groschup, una è del centro di referenza olandese (J. Lagenveld) e una è stata sviluppata in Italia dall'Istituto Superiore di Sanità (R. Nonno).
Queste metodologie sono per adesso utilizzate dai soli sviluppatori e dovranno essere trasferite in seguito presso i centri di referenza di ogni singolo stato membro.
Il processo di validazione e di selezione delle metodiche ha permesso di apportare sostanziali modifiche al regolamento 999/2001 (13 gennaio 2005) in materia di discriminazione tra le TSE ovina e bovina. Il procedimento di analisi è stato suddiviso in 4 stadi:
1. Nella prima fase ogni caso trovato positivo per scrapie, determinato sia con i test rapidi validati dalla Commissione Europea, sia attraverso la sorveglianza passiva, deve essere confermato dai centri di referenza nazionali.
2. Ogni caso confermato viene inviato ai centri approvati dalla Commissione Europea per la discriminazione scrapie/BSE:
a. Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments, Laboratorio di patologia bovina, Lione;
b. Veterinary Laboratories Agency (VLA), New Haw, Addlestone, Regno Unito;
c. Federal Research Centre for Virus Diseases of Animals Tubingen, Germania;
d. Laboratorio di Medicina Veterinaria, Istituto Superiore di Sanità, Roma;
e. Central Institute for Animal Disease Control, Lelystad, Olanda.
Tutti i campioni compatibili con la scrapie vengono definitivamente archiviati come casi di scrapie. Tutti gli isolati che diano risultati incompatibili con la scrapie vanno riferiti al CRL per i test successivi.
3. Ogni caso riferito al CRL STEG verrà ulteriormente investigato tramite ring trial con altri metodi discriminatori. In particolare si prevede l'utilizzo di metodi differenti rispetto a quelli usati in prima battuta, come ad esempio i test ELISA e metodi immunoistochimici descritti precedentemente, o ulteriori western blotting diversi da quelli usati nella prima fase.
4. In caso di ulteriore positività il caso deve essere analizzato mediante strain typing in vivo su topi per fornire l'ultima conferma.
Conclusioni
La ricerca di un metodo per la distinzione tra le TSE ovina e bovina ha portato all'utilizzo di metodiche molecolari per garantire praticità e velocità di esecuzione e per garantire lo screening su larga scala degli ovini. Anche se negli ultimi anni sono stati fatti numerosi passi avanti, la Commissione Europea ha comunque stabilito, nella codifica delle fasi di distinzione scrapie/BSE, il ricorso all'utilizzo dello strain typing su topo, per garantire la conferma finale alla positività del campione.
Il 15 luglio 2005 la Commissione Europea ha pubblicato un documento di riflessione sulle TSE, la "TSE roadmap" (http://europa.eu.int/comm/food/food/biosafety/bse/roadmap_en.pdf), che riassume la situazione attuale sulle encefalopatie spongiformi trasmissibili in Europa, e delinea, in base anche ai nuovi sviluppi tecnologici, un possibile futuro delle strategie da adottare, per minimizzare sia i rischi per il consumatore, sia l'impatto economico delle TSE sugli allevamenti.
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Legislazione
REGOLAMENTO (CE) N. 999/2001 del parlamento europeo e del consiglio, del 22 maggio 2001 recante disposizioni per la prevenzione, il controllo e l'eradicazione di alcune encefalopatie spongiformi trasmissibili.
REGOLAMENTO (CE) n. 1248/2001 della Commissione, del 22 giugno 2001, che modifica gli allegati III, X e XI del regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio in materia di sorveglianza epidemiologica e test per l'individuazione delle encefalopatie spongiformi trasmissibili.
REGOLAMENTO (CE) N. 1053/2003 della Commissione del 19 giugno 2003 che modifica il regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda i test rapidi.
REGOLAMENTO (CE) N. 2245/2003 della Commissione del 19 dicembre 2003 che modifica il regolamento (CE) N. 999/2001 del parlamento europeo e del consiglio che modifica la sorveglianza delle encefalopatie spongiformi degli ovini e nei caprini.
REGOLAMENTO (CE) N. 1915/2003 della Commissione del 30 ottobre 2003 recante modifica degli allegati VII, VIII e IX del regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda il commercio e l'importazione di animali delle specie ovina e caprina, nonché le misure da attuare in seguito alla presenza conclamata di encefalopatie spongiformi trasmissibili in ovini e caprini.
REGOLAMENTO (CE) N. 36/2005 della Commissione del 12 gennaio 2005 che modifica gli allegati III e X del regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda la sorveglianza epidemiologica delle encefalopatie spongiformi trasmissibili nei bovini, negli ovini e nei caprini.
REGOLAMENTO (CE) N. 260/2005 della Commissione del 16 febbraio 2005 che modifica il regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda i test diagnostici rapidi.
REGOLAMENTO (CE) N. 214/2005 della Commissione del 9 febbraio 2005 che modifica l'allegato III del regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda la sorveglianza epidemiologica delle encefalopatie spongi
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Ringraziamo il Dottor Simone Barocci dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche, per la revisione del testo.
