Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria - Numero 30, maggio-giugno 2005 [http://spvet.it]Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/indice-spv.html#283
Spreading of antibiotics resistance genes in Salmonella enterica serotype Typhimurium phage-type DT104 and related fagotype. Detection through PCR multiplex essay
Analisi della diffusione di geni di resistenza antibiotica di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium fagotipo DT104 e fagotipi correlati mediante un saggio di PCR multiplex.
Staffolani M., Striano G., Perugini G. e Fisichella S.
Summary: Salmonella infections are increasing worldwide both in human field and in veterinary one. As well antibiotic resistance phenomena among Salmonella serotypes is increasing every year. In particular since 1990s the phage-type DT104 of Salmonella Typhimurium has become a global problem owing to chromosomal integration of resistance genes.
In this work we used the PCRm assay that was originally used to detect multiresistant Salmonella Typhimurium DT104 and U302 by some American authors to analyse 84 strains stored in Marche Regional Reference Centre and isolated from 1997 to 2004. This group is composed by 75 multiresistant strains and 9 sensible strains used as negative controls.
Our results demonstrate that this PCRm assay is a useful and repeatable method to identified multiresistant strains of Salmonella Typhimurium DT104 and related phage types and to improve the surveillance of R-genes mobility contained in the chromosomal SGI-1.
Riassunto: Le infezioni sostenute da Salmonella sono in crescita in tutto il mondo e interessano sia la medicina umana che quella veterinaria.
Anche i fenomeni di resistenza agli antiobiotici nei sierotipi di Salmonella si accresccono di anno in anno.
In particolare dagli anni '90 il fagotipo DT104 di Salmonella Typhimurium è diventato un problema globale per la integrazione negli stessi cromosomi dei geni della resistennza.
In questo lavoro abbiamo utilizzato il saggio PCRm originariamente impiegato per rilevare la multiresistenza di Salmonella Typhimurium DT104 e U302 da alcuni autori statunitensi (lavoro effettuato su 85 ceppi del patogeno, isiolati dal 1997 al 2004 e conservati presso il Centro di Referenza regionale delle Marche).
Questo gruppo è composto da 75 varietà multiresistenti e 9 sensibili impiegate come controllo negativo.
I nostri risultati mostrano che questi tipo di saggio (PCRm) è un utile e ripetibile metodo per identificare ceppi multiresistenti di Salmonella Typhimurium DT104 e fagotipi correlati, impiegabile per migliorere la sorveglianza della mobilità degli R-genes contenuti nel cromosoma SGI-1.
INTRODUZIONE
Lo scopo di questo lavoro è utilizzare un saggio di PCR multiplex (PCRm) per tracciare la diffusione dell'isola genomica 1 di Salmonella (SGI1) (1, 2) e, in particolare, di due geni di resistenza antibiotica contenuti in tale regione di DNA piuttosto specifici di Salmonella Typhimurium DT104, fagotipo caratterizzato generalmente dal profilo di resistenza antibiotica ACSSuT/ASSuT (Ampicillina, Cloramfenicolo, Streptomicina, Sulfamidico, Tetraciclina) (3-5).
Tale patogeno risulta ampiamente diffuso in tutto il mondo ed è stato ritrovato nell'uomo nonchè in un'ampia varietà di specie animali. Inoltre da alcuni anni il fenomeno della multiresistenza ha acquisito proporzioni preoccupanti nel genere Salmonella e il fagotipo DT104 risulta in gran parte responsabile.
Recentemente, infatti, alcuni studi hanno riportato che i geni di resistenza antibiotica non si trovano su DNA plasmidico ma sul DNA cromosomico di DT104 (6-8 ) e questo consente la trasmissione verticale della resistenza anche in assenza di pressione selettiva.
Tali studi, inoltre, hanno messo in luce che tutti i geni della multiresistenza sono arrangiati in due integroni, cassette mobili di DNA che facilitano il trasferimento dei geni, a loro volta contenuti nella SGI1.
Tra i 5 geni di resistenza in questione, due sono piuttosto rari nel genere Salmonella e quindi ottimi candidati per un saggio specifico: PSE-1 (gene codificante una ß-lattamasi che conferisce resistenza all'ampicillina) e floR (gene codificante una pompa a efflusso che conferisce resistenza al cloramfenicolo).
Infatti alcuni autori (9) hanno messo a punto un saggio di PCRm che, stando ai loro studi, risulta essere assolutamente specifico così come per altri autori che lo hanno impiegato (10, 11), mentre altri autori hanno ottenuto risultati discordanti in quanto la SGI1 è stata rivelata anche in altri fagotipi e sierotipi (12, 13).
In questo lavoro il saggio di PCRm in questione è stato testato su 84 ceppi di Salmonella conservati presso la ceppoteca del Centro di Riferimento Regionale isolati nella regione Marche dal 1997 al 2004. Tra questi sono stati inclusi 75 ceppi multiresistenti e 9 ceppi non resistenti usati come controllo negativo.
I 75 ceppi multiresistenti comprendono in maggioranza i sierotipi che attualmente occupano i primi tre posti in frequenza in ambito umano: S. Typhimurium, S. Enteritidis e Salmonella monofasica 4,5,12:i:- (isolata per la prima volta in Spagna nel 1997 e poi riscontrata in tutta Europa e negli USA).
MATERIALI E METODI
Ceppi batterici
Sono stati analizzati mediante PCRm e sottoposti ad antibiogramma 84 ceppi di Salmonella (tabella N° 1 e 1 bis) precedentemente identificati biochimicamente e sierotipizzati tramite agglutinazione su vetrino utilizzando sieri del commercio (Statens Serum Institut-Biogenetics Danimarca).
Essi sono stati opportunamente selezionati in base al sierotipo e alla presenza di resistenza multipla e sono stati isolati nella regione Marche durante gli ultimi 7 anni dal 1997 al 2004.
Inoltre per tutti i ceppi di Salmonella appartenenti ai sierotipi Typhimurium, Enteritidis e Salmonella monofasica 4,5,12:i:- è stato determinato anche il fagotipo.
Antibiogramma
L'antibiogramma è stato eseguito secondo la tecnica della diffusione su dischetto seguendo le linee guida dell'NCCLS per l'interpretazione degli aloni di inibizione (14).
Per i controlli di qualità sono stati impiegati ceppi inviati dal DFVF-Danish Institute for Food and Veterinary Research e ceppi di E. coli ATCC 25922.
Gli isolati sono sati piastrati su Muller-Hinton agar (Biolife, Milano, Italia) e per il test sono stati impiegati dischetti antibiotici del commercio (Oxoid, Hampshire, England e Mast Diagnostics, Merseyside, UK).
Per i ceppi umani sono stati saggiati 13 antibiotici alle seguenti concentrazioni: Ampicillina (A) 10, Cloramfenicolo (C) 30, Streptomicina (S) 10, Sulfonamidi (Su) 300, Tetraciclina (T) 30, Acido nalidixico (Nal) 30, Cefotaxime (Ctx) 30, Ciprofloxacina (Cip) 5, Gentamicina (Gm) 10, Kanamicina (Kan) 30, Amoxicillina-acido clavulanico (Amc) 30, Trimethoprim-Sulfametossazolo (Sxt) 1.25/23.75 e Cefalotina (Kf) 30.
Per i ceppi di origine non umana sono stati saggiati in aggiunta altri 3 antibiotici: Colistina (Cl) 10, Enrofloxacina (Enr) 5 e Neomicina (Neo) 30.
Riguardo i 15 ceppi di S. Typhimurium fagotipo DT104 e resistotipo ACSSuT, è stata valutata anche la sensibilità al Florfenicolo (Flo) 30.
Fagotipizzazione
La fagotipizzazione di Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis e Salmonella monofasica 4,5,12:i:- è stata eseguita presso i due centri di riferimento nazionali per le salmonelle: a Roma presso l'Istituto Superiore di Sanità per i ceppi umani, e all'Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie a Legnaro (Padova) per i ceppi di origine non umana.
La fagotipizzazione è stata eseguita impiegando metodiche standard (15) usando i fagi forniti dall' International Phage-typing Reference Laboratory (Health Protection Agency, London, UK).
Isolamento del DNA
Una o due colonie del ceppo batterico puro cresciuto su terreno agarizzato Tryptone Soya Agar (TSA), sono state risospese in 500 µl di acqua distillata sterile e trattate a 100°C per 10 minuti.
Il lisato cellulare così ottenuto è stato poi sottoposto a centrifugazione (13000 rpm 5 minuti) e il sovranatante e stato immediatamente separato dal precipitato, aliquotato e posto a - 20°C in attesa del saggio di PCRm.
PCR multiplex
Per il saggio di PCRm sono state impiegate tre coppie di primers descritte originariamente da Carlson et al. (9) (tabella N° 2) e usate con successo anche da altri autori (10, 11).
Occorre precisare che la coppia di primers per il gene floR riconosce la zona marginale 3' e la parte affiancata 5' del gene regolatore tetR. Questo consente, oltre alla rivelazione dei ceppi multiresistenti del tipo ACSSuT, la rivelazione dei ceppi del tipo ASSuT nei quali manca la resistenza al cloramfenicolo a causa di una delezione in 5' nel gene floR (9).
Il saggio è stato eseguito in un volume di 25 µl contenenti: 2.5 µl di Buffer 10X privo di MgCl2, 1 µl di dNTP mix 10mM, 2.5 µl di MgCl2 25 mM, 4 picomoli di ciascun primer, 2 unità di AmpliTaq Gold e 2 µl di DNA.
La preincubazione è di 95°C per 5 minuti ed è seguita da 40 cicli sotto le seguenti condizioni: 1 minuto a 45°C, 30 secondi a 48°C e 30 secondi a 72°C. Dopo l'ultimo ciclo i campioni sono stati incubati per 3 minuti a 72°C e poi a 4°C.
Infine 12.5 µl dell'amplificato sono stati sottoposti ad elettroforesi su gel d'agarosio al 2% in tampone TBE (Tris Borato EDTA) e visualizzati mediante un trasilluminatore UV dopo colorazione con bromuro di etidio.
RISULTATI
Sono stati testati 84 ceppi di cui 75 multiresistenti e 9 non resistenti usati come controllo negativo (4 ceppi di S. Typhimurium, 4 ceppi di S. Enteritidis e un ceppo di S. Dublin). E' stato anche incluso un ceppo di E. coli ATCC 25922 come ulteriore controllo negativo.
Alcuni dei risultati del saggio di PCRm sono presentati nella Figura 1.
Agarose gel electrophoresis of amplicons observed following PCR for multiresistant DT104 genes of Salmonella isolates. Lane 1: molecular weight standard 50 bp (MBI Fermentas); lane 2: N° 35122/02 S. Typhimurium DT104 ACSSuT; lane 3: N° 43183/02 S. Typhimurium DT104 ACSSuT; lane 4: N° 897/03 S. Typhimurium DT120 ACSSuT; lane 5 N° 6410/03 S. Typhimurium DT104 ASSuT; lane 6: N° 26757/02 S. Typhimurium DT104 U302 ACSSuT; lane 7 N° 12951/03 S. Typhimurium U302 ASSuT; lane 8: controllo negativo; lane 9: E. coli ATCC 25922; lane 10: N° 46095/02 S. Typhimurium U302 ASSuT+Nal; lane 11 N° 13378/03 S. Typhimurium U302 nessuna resistenza; lane 12 N° 46078/02 S. Typhimurium NT ASSuT; lane 13: N° 40423/02 S. Typhimurium DT120 sensible; lane 14: N° 1349-99 AP S. Blockley ACST+Nal.Kan.Gm.Neo; lane 15: N° 45234/03 S. Enteritidis ACSSuT+Nal.Sxt; lane 16 N° 42019/03 S. Panama ASSuT+Nal.Kf.Sxt.
Riguardo il sierotipo Typhimurium sono stati analizzati 45 ceppi di cui 16 appartenenti al fagotipo DT104 (13 di origine umana e 3 isolati da gatti randagi).
Tra questi ultimi sono stati inclusi 10 resistotipi ACSSuT, tre resistotipi ACSSuT+Flo, un resistotipo ACSSut+Kan, un resistotipo ACSSuT+Amc.Sxt e un resistotipo ASSuT. I 16 ceppi DT104 sono risultati tutti positivi in PCRm in quanto hanno presentato le tre bande relative al gene di genere sipB/C e ai 2 geni di resistenza PSE-1 e floR.
Riguardo Salmonella Typhimurium fagotipo U302 sono stati analizzati 11 ceppi (7 di origine umana, 2 isolati da carne lavorata suina e bovina e uno isolato da fanghi di depurazione) tra cui un ceppo non resistente che presenta solo la banda del gene sipB/C e 10 ceppi multiresistenti. Tra questi ultimi, 7 hanno presentato le tre bande, mentre 3 ceppi con resistotipo ASSut+Nal hanno presentato solo la banda di genere sipB/C.
Sono stati analizzati anche alcuni ceppi multiresistenti e non di S. Typhimurium di diverso fagotipo (cinque DT120 di cui 2 non resistenti, un DT12 resistente , un DT194 non resistente e undici NT resistenti). Tutti i campioni hanno presentato la sola banda di genere relativa al gene sipB/C, eccetto due ceppi: la salmonella N° 897 ACSSuT fagotipo DT120 di origine umana e la salmonella N° 27578 ACSSut+Sxt.Amc fagotipo DT12 isolata da un pappagallo domestico.
Riguardo i sierotipi diversi da Typhimurium, sono stati saggiati: 10 ceppi di S. Enteritidis (tra cui 4 non resistenti), 9 ceppi di S. Blockley, 3 ceppi di S. Panama, 3 ceppi di S. Hadar, 10 ceppi di Salmonella monofasica 4,5,12:i:- e 5 ceppi singoli di S. Virchow, S. Dublin, S. Heidelberg, S. Derby e S. Dublin (non resistente). I 39 ceppi sopramenzionati sono risultati tutti negativi in PCRm poiché hanno presentato solo la banda sipB/C relativa al marcatore di genere.
I 9 ceppi non resistenti usati come controllo negativo, come era da attendersi, non hanno presentato le due bande relative ai due geni di resistenza, mentre tutti gli 84 ceppi di Salmonella hanno presentato la banda relativa al genere (sipB/C), naturalmente assente nel ceppo di E. coli ATCC 25922.
DISCUSSIONE
I risultati dimostrano che il saggio in questione può essere considerato un metodo valido e ripetibile per la rivelazione dei ceppi di S. Typhimurium DT104 multiresistenti e degli altri fagotipi che potenzialmente possono diventare tali.
In particolare i 16 ceppi di S. Typhimurium DT104 selezionati hanno mostrato una correlazione del 100% tra fagotipo, resistotipo e profilo di PCRm, ma si sono rivelati positivi anche 7 ceppi del fagotipo U302, un fagotipo DT12 e un fagotipo DT120. In altri termini, il saggio di PCRm in questione, che originariamente era stato messo a punto allo scopo di rivelare il fagotipo DT104 multiresistente in alternativa alla fagotipizzazione (9), a nostro avviso è più utile come metodo per monitorare la diffusione e studiare la mobilità della SGI1 che conferisce la multiresistenza.
Non a caso, infatti, i fagotipi che sottoposti alla PCRm presentano lo stesso profilo genico di DT104 (essenzialmente U302, DT120 e DT12), sono strettamente correlati ad esso e si pensa che possano aver acquisito lo stesso gruppo di geni o che possano essere derivati da DT104 per un cambiamento nella sensibilità fagica (16).
Quindi a nostro avviso non è possibile per ora sostituire il test tradizionale di fagotipizzazione allo scopo di rivelare la presenza del fagotipo DT104 multiresistente, in quanto il saggio di PCRm non si è rivelato del tutto specifico.
Tuttavia è bene sottolineare che il saggio di PCRm oggetto dello studio è molto rapido (5 ore dopo aver impiegato 2 giorni per l'isolamento e la sierotipizzazione) è può quindi essere facilmente affiancato alle tradizionali analisi di routine come utile mezzo per monitorare la diffusione e la mobilità dell'isola SGI1 contenente i geni cromosomici di resistenza.
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Poster presentato al 4° Workshop nazionale Enter-Net ISS Roma il 24 e 25 novembre 2004
