Summary: Recently, so-called "new technologies" have widely involved the whole Public Health field, both human and veterinary. Technological innovations, focused on the reduction of costs and analytical times, become necessary to create connections in research programs, which allow to exploit more efficient and effective analytical methods.
In this view, the Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche (IZSUM) collaborates since 2001 with the Molecular and Cellular Animal Biology Department of the University of Camerino (UNICAM), a reference institution in the national panorama of research activities.
With the support of national researches financed by the Italian Health Ministry, IZSUM and UNICAM focused on two very important fields in the Public Health field: Transmissible Spongiform Encephalopaties (bovine BSE in particular) and micotoxins (a milk and other food contaminating group of toxins).
Applications apart, however, the wide versatility of the method used is very interesting. In fact this technology permits to analyze the interactions between macromolecules which could be used for diagnostic aims.
In both the mentioned studies a new technology based on biosensors has been exploited: this technology allows the user to obtain reproducible results in short time with high sensibility and specificity.
In this paper the main features of the Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor are described, as an introduction to some applications developed from IZSUM/UNICAM collaboration, which will be described in following papers.
Riassunto: Recentemente, le cosidette “new technologies" hanno ampliamente coinvolto tutti i campi della Sanità Pubblica.
Le innovazioni tecnologiche, oltre a focalizzarsi sulla riduzione dei costi e dei tempi di analisi, dovrebbero creare dei collegamenti tra i programmi di ricerca, ciò permetterebbe uno sfruttamento più efficiente e concreto dei metodi analitici.
Da questo punto di vista l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche (IZSUM) dal 2001 collabora con il Dipartimento di Biologia Animale Molecolare e Cellulare
dell’Università di Camerino (UNICAM), un istituto di riferimento nel panorama nazionale delle attività di ricerca.
Con il supporto dei finanziamenti nazionali per la ricerca del Ministero della salute, IZSUM e UNICAM si sono concentrate in due campi molto importanti della Salute Pubblica:
le Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (in particolare la BSE bovina) e le micotossine
(un gruppo di tossine che contaminano il latte ed altri alimenti).
Oltre alle note applicazioni, la grande versatilità dei metodi analitici utilizzati è decisamente interessante. Infatti questa tecnologia permette di analizzare le interazioni tra macromolecole per poi utilizzare le informazioni ottenute a scopi diagnostici.
In entrambi i studi appena menzionati viene sfruttata una nuova tecnologia basata sui biosensori: tale tecnica consente di ottenere risultati riproducibili in poco tempo e, contemporaneamente, presenta un’elevata sensibilità e specificità.
In questo articolo vengono descritte le principali caratteristiche del biosensore della Surface Plasmon Resonance (SPR), al fine di introdurre alcune applicazioni sviluppate dalla collaborazione tra IZSUM/UNICAM.
INTRODUZIONE
Negli ultimi anni le cosiddette "nuove tecnologie" hanno ampiamente investito l'intero settore della Sanità Pubblica, sia essa umana che veterinaria. In questa ottica di innovazione tecnologica, che ha principalmente l'intento di abbattere i costi, ma soprattutto di ottenere minori tempi di risposta, diventa ormai necessario inserirsi in programmi di ricerca che permettano di sfruttare metodi analitici più efficienti ed efficaci. In questa ottica l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche (IZSUM) collabora dal 2001 con il Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare Animale dell'Università degli Studi di Camerino (UNICAM), che risulta essere un polo di riferimento a livello nazionale per le attività di ricerca svolte.
Per mezzo di ricerche finanziate dal Ministero della Salute, IZS ed UNICAM si sono concentrati su due temi di grande importanza nel panorama della Sanità Pubblica: le Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE, fra cui la ben nota BSE dei bovini) e le micotossine (tossine contaminanti di latte ad altri tipi di alimenti).
A parte queste due applicazioni, risulta molto interessante l'ampia versatilità della metodica utilizzata, in quanto permette di analizzare le interazioni fra le principali macromolecole che possono servire a scopo diagnostico.
In entrambi i menzionati campi di studio è stata sfruttata una nuova tecnologia basata sui biosensori, che permettono di avere risultati riproducibili in tempi ridotti con alte sensibilità e specificità.
In questo lavoro sono descritte le principali caratteristiche del biosensore che sfrutta la tecnologia Surface Plasmon Resonance (SPR), come introduzione ad alcune applicazioni sviluppate dalla collaborazione IZSUM/UNICAM che verranno descritte in lavori seguenti.
BIOSENSORI
Definizione IUPAC: "un biosensore è un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive, o tessuti, o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi l'informazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi, in un segnale utile analiticamente. L'interazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento, Fig. 1) è alla base del corretto funzionamento di un biosensore".
I biosensori rilevano interazioni fra (macro)molecole biologiche.
Figura 1: concetto di biosensore
Ciò è possibile grazie all'utilizzo di macromolecole di origine biologica (molecola immobilizzata di riconoscimento, specie gialla Fig.1) integrate in un sistema di trasduzione del segnale fisico. Questo segnale deriva dall'interazione specifica fra la specie ricercata (analita target, molecola rossa Fig.1) e l'elemento sensibile stesso.
Le interazioni biomolecolari possono essere monitorate direttamente utilizzando il cosiddetto "sensore a campo evanescente". Questa tecnica si basa sul fenomeno ottico della risonanza plasmonica supeficiale (SPR).
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Biosensore SPR
La risonanza plasmonica superficiale (SPR) è una oscillazione della densità di carica che può aver luogo all'interfaccia tra due mezzi con costanti dielettriche di segno opposto, come ad esempio, un metallo ed un dielettrico (materiale caratterizzato da una conducibilità elettrica molto bassa e perciò usato come isolante elettrico). L'onda di densità di carica è associata con un'onda elettromagnetica, i cui vettori di campo raggiungono il massimo all'interfaccia, per poi decadere e svanire velocemente in entrambi i mezzi ("evanescente").
Un biosensore SPR consta di un prisma con un sottile strato metallico depositato su una sua superficie, una sorgente di luce polarizzata, un detector che misuri l'intensità di luce totalmente riflessa ed un volume che contenga il mezzo nel quale è presente l'analita.
Dalle leggi dell'ottica geometrica è noto che per angoli di incidenza maggiori dell'angolo critico (cioè per Θ ≥ Θc), si ha riflessione totale. Inoltre è noto che:
con εa > εg
(εa ed εg sono le costanti dielettriche del mezzo e del prisma).
Sperimentalmente, quando si misura l'intensità della luce totalmente riflessa, si ottiene che essa non è costante al variare dell'angolo della luce incidente Θ. Quando infatti Θ si avvicina ad un valore specifico Θsp, l'intensità della luce riflessa, R(Θ), decade bruscamente. Ciò avviene perché in corrispondenza di Θ = Θsp, parte del campo elettromagnetico associato alla radiazione luminosa, viene assorbito dalla superficie metallica, sulla quale viene attivato il cosiddetto campo elettrico evanescente.
Figura 2: schema SPR
Principio del funzionamento
La macromolecola viene immobilizzata sulla superficie metallica e viene quindi aggiunto un analita in soluzione; questo può essere riconosciuto dalla macromolecola, andando a formare un complesso macromolecola-analita.
La formazione di tale complesso modifica le proprietà dell'onda evanenescente, o in altre parole modificherà l'indice di rifrazione del mezzo. La derivante variazione dell'angolo di risonanza, Qsp, è direttamente proporzionale alla quantità di ligando legato alla macromolecola.
Il lettore ottico del biosensore misura lo spostamento dell'angolo SPR e la risposta dipende anche dall'indice di rifrazione del volume della soluzione in prossimità del film metallico.
I dati grezzi sono presentati in tempo reale in un grafico (sensorgramma, Fig.3) su computer collegato al biosensore, in unità di risposta (arcsec nel caso dell'IAsys, cioè variazione dell'angolo di risonanza in funzione tempo).
Il principio su cui si basa la rilevazione limita la grandezza dell'analita ricercato. Molecole di peso molecolare inferiore a 100-200 Da, indurranno un cambiamento nell'indice di rifrazione durante il legame che è troppo basso per essere rilevato direttamente.
La grandezza delle macromolecole in studio è inoltre dipendente dalla profondità di penetrazione dell'onda evanescente di 300-400 nm. Particelle più grandi di 400 nm non possono essere misurate completamente. Il risultato in tal caso è un segnale non lineare relativo alla quantità di particelle legate. In queste circostanze, non può essere eseguita un'analisi quantitativa o cinetica, ma è comunque possibile effettuare uno studio di legame qualitativo.
La sensibilità di questa metodica permette di rilevare quantità ridotte di analita (fino a ng).
Fig. 3 - Sensorgramma
Il sistema dell'UNICAM
Lo strumento IAsys, un biosensore a guide d'onda per lo studio di interazioni biomolecolari, permette il costante controllo delle reazioni, così da consentire lo studio della dinamica e della forza di legame. L'analisi viene condotta rapidamente utilizzando ridotte quantità di materiale e senza la necessità di marker o di step di purificazione.
Anche l'IAsys è basata sul fenomeno ottico del campo evanescente. Questo fenomeno si manifesta quando la luce subisce una riflessione interna totale (TIR) e ne risulta incrementata nell'intensità per passaggio attraverso una struttura a guida d'onda, chiamata specchio di risonanza (Fig. 4): ciò è dovuto alla formazione di una cavità di risonanza (o guida d'onda) ed ad una quasi completa riflessione della luce. Nella TIR, per angoli superiori all'angolo critico, le onde luminose sono completamente riflesse. Il campo elettrico, ad ogni modo, non si estingue in maniera discontinua e penetra approssimativamente per una lunghezza d'onda nel mezzo a basso indice di rifrazione, decadendo esponenzialmente. Questo campo è denominato campo evanescente e la sua intensità aumenta con l'angolo di risonanza del biosensore. Questo angolo di risonanza è altamente sensibile all'indice di rifrazione della superficie. L'utilizzo del campo evanescente per esaminare l'indice di rifrazione conferisce una selettività di superficie al sensore, e non saranno rilevati cambiamenti che avvengano al di fuori della superficie stessa. In tal modo, mediante immobilizzazione del ligando sulla superficie del sensore, è possibile effettuare esclusivamente misure su quelle molecole (ligato) che si legano o che si dissociano dal ligando.
Lo specchio di risonanza è una struttura semplice, costituita da due strati dielettrici su vetro, che permettono prestazioni elevate e riproducibili.
Il dispositivo consiste in una guida d'onda ed in un prisma, entrambi ad alto indice, separati da uno strato di collegamento interposto a basso indice. Cambiamenti dell'indice di rifrazione sulla superficie dello strumento, provocano una modificazione dell'angolo al quale la luce si propaga nella guida d'onda.
Figura 4: configurazione specchio di risonanza
Un raggio laser (λ =670 nm) sonda per un angolo di 10° intorno al dispositivo. Raggiunto l'angolo di risonanza, la luce di alta intensità passa dal prisma, attraversa lo strato di collegamento, per propagarsi poi nella guida d'onda come onda evanescente superficiale. Il processo di attraversamento è reversibile, il che permette la fuoriuscita di parte della luce.
La luce quindi torna indietro attraverso lo strato di collegamento, per poi raggiungere il detector. Per una corretta risoluzione dell'angolo di risonanza, i componenti della struttura ottica sono disposti in modo da ottenere una rotazione della polarizzazione di 90°.
Viene utilizzato un sistema di rivelazione in fase, al fine di isolare esclusivamente la componete della luce che si propaga attraverso lo strato di risonanza.
Un polarizzatore, collocato davanti al detector, permette un'accurata distinzione dell'angolo in esame; tale dispositivo è estremamente sensibile al campo evanescente della luce che si propaga attraverso lo strato di risonanza, che è indice delle reazioni di formazione o scissione di legami sulla superficie del sensore. L'intensità del campo evanescente decade esponenzialmente, e dopo 100 nm è ridotta ad un terzo della sua intensità.
Tale andamento assicura che vengano analizzate esclusivamente le interazioni delle specie immobilizzate. Qualsiasi materiale che dal campione entri all'interno del campo evanescente, provocherà un'alterazione del profilo dell'indice di rifrazione nelle vicinanze della superficie del dispositivo, cambiando così l'angolo di risonanza. Il cambiamento nella posizione del picco di intensità può essere seguito accuratamente, intervallando i campionamenti fino a tre al secondo.
Immobilizzazione delle macromolecole
L'IAsys è in grado di rilevare fenomeni molecolari di dissociazione e di associazione attraverso cambiamenti di massa sulla superficie del biosensore.
Per questo, quando si analizza l'interazione fra una macromolecola immobilizzata ed un analita in soluzione, è essenziale accertarsi che l'analisi non sia complicata da una perdita di ligando dalla superficie del biosensore.
Di conseguenza, è necessario immobilizzare il ligando irreversibilmente.
È un requisito fondamentale che una sotto-popolazione significativa di ligando immobilizzato mantenga l'attività nativa di binding, in modo da ottenere un'interpretazione significativa dell'interazione con il ligato.
Ciò ha effetto sulla scelta dei metodi di immobilizzazione scelti per i particolari sistemi e classi di analisi di interazione. Il grado di immobilizzazione del ligato è un aspetto chiave, in particolare nel caso di misure assolute o comparative.
In generale i livelli di immobilizzazione dovrebbero essere il più possibile bassi in riferimento al particolare sistema, allo scopo di minimizzare l'ingombro sterico ed altre complicazioni per l'analisi cinetica.
Infine la strategia di immobilizzazione deve essere concepita in modo da prevedere ripetute rigenerazioni del ligando. Le diverse strategie di immobilizzazione (es: EDC/NHS) e l'uso di superfici differentemente funzionalizzate (carbossiato, CMD, aminosilano, biotina, etc.) dipendono dalla struttura e dalle proprietà dei binding partner di cui si vorrà caratterizzare l'interazione.
Analisi dei dati
Misure dirette della variazione dell'angolo di risonanza consentono determinazioni quantitative di concentrazioni di analiti. La variazione nel tempo del segnale SPR viene analizzata dal computer per ottenere mediante regressione il valore delle costanti di associazione (kass) e dissociazione (kdiss) delle interazioni in esame.
Il rapporto di questi valori fornisce il valore della costante di affinità (KD=kdiss/kass). L'entità del cambiamento nel segnale SPR è direttamente proporzionale alla massa immobilizzata e può quindi fornire dati per il calcolo della stechiometria della reazione.
Sono facilmente ottenibili segnali da quantità di specie inferiori ai microgrammi. Visto che il segnale SPR dipende unicamente dal legame alla specie immobilizzata, è possibile studiare legami di molecole presenti in estratti (non è necessario avere componenti estremamente purificati).
Durante l'iniezione dell'analita, i cambiamenti nel segnale risultano dall'effetto degli eventi di associazione e dissociazione tra i "binding partners". Alla fine dell'iniezione il cambiamento del segnale dipende solamente dalla dissociazione.
Dal sensogramma è possibile derivare un insieme di conclusioni:
definire se esiste una interazione specifica fra le specie in studio,
trovare analiti che si legano in modo più "forte" rispetto ad altri,
capire se le condizioni di rigenerazione permettono di ritornare al segnale iniziale,
studiare se, dopo la rigenerazione, la superficie del biosensore è riutilizzabile.
VANTAGGI DELLA METODICA
Di seguito sono descritti i principali vantaggi che abbiamo con i biosensori.
Monitoraggio in tempo reale del legame fra le specie in questione (rispetto ad ELISA, RIA, cromatografia di affinità e spettroscopia)
Marcatura non necessaria delle molecole che interagiscono fra loro
Protocolli con meno fasi, che quindi hanno meno punti critici
Processività complessiva medio-alta
Alto costo iniziale per la strumentazione, ma abbattimento dei costi per i seguenti accertamenti analitici
Lunga durata delle superfici "sensibilizzate" che possono essere riutilizzate per più analisi, qualora la procedura non causi al distruzione di legante e/o ligando
Semplice e veloce utilizzo dell'apparecchiatura
Sistema stabile e riproducibile
Alta precisione, sensibilità e selettività
Rapidità di risposta
Pochissimi reagenti utilizzati
Minima preparazione del campione
Spesso possibilità di calibrazione interna
APPLICAZIONI
È evidente come tale metodica analitica possa interessare ogni settore speculativo, dalla ricerca di base agli aspetti applicativi della diagnostica in campo sia umano che veterinario.
La collaborazione con l'Università di Camerino, finanziata dal Minisero della Salute attraverso due ricerche correnti, ha permesso all'IZSUM di poter creare protocolli sperimentali di utilizzo di biosensori, affiancati alle metodiche tradizionali, nell'attività di diagnostica della sanità animale e di ricerca di sostanze contaminanti.
Questo evidenzia come queste apparecchiature sono già oggi, ma soprattutto per il prossimo futuro, strumenti importantissimi che potranno dare moltissime informazioni in vari settori.
Sono attualmente in corso dei progetti nei campi delle TSE (rilevazione agente infettivo e genotipizzazione) e delle MICOTOSSINE (rilevazione di aflatossine purificate), che, come accennato, verranno descritti in seguento.
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