Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 99, Dicembre 2016 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/indice-spv.html#643
Studio preliminare sulle caratteristiche epidemiologiche di Y. enterocolitica isolata da matrice umana, animale e alimentare
Preliminary study on the epidemiological characteristics of
Y. enterocolitica isolated from human, animal and food matrix
Sara Primavilla1, Chiara Francesca Magistrali1, Giuliana Blasi1, Lucilla Cucco1, Serenella Orsini1, Elisabetta Delibato2, Silvana Farneti1
1. Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
2. Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare. Istituto Superiore di Sanità. Roma
Abstract. Yersiniosis is the third most frequently notified zoonotic disease (EFSA, 2013) and species enterocolitica, in particular, is very widespread in the environment and in animals. The epidemiology of the infection with Y. enterocolitica is complex and still poorly understood.
In this study we characterised strains of Y. enterocolitica isolated from human patients, food, animals and environment, in Umbria and Marche regions from 2003 to 2016, in order to eventually find epidemiologic correlations
Riassunto. La yersiniosi si colloca al terzo posto tra le zoonosi più frequentemente notificate (EFSA, 2013) e la specie enterocolitica, in particolare, risulta essere molto diffusa nell'ambiente e tra gli animali. L'epidemiologia dell'infezione da Yersinia enterocolitica è complessa e ad oggi rimane ancora scarsamente compresa.
In questo studio sono stati caratterizzati ceppi di Y. enterocolitica isolati da uomo, alimenti, animali e ambiente, in Umbria e Marche, dal 2003 al 2016, al fine di evidenziare eventuali correlazioni epidemiologiche tra gli isolati
Introduzione
L'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche (IZSUM) dedica una parte consistente della propria attività alla valutazione dei fattori di rischio zoonosico nelle diverse fasi delle filiere zootecniche, a livello di allevamento, macellazione, lavorazione degli alimenti e distribuzione.
Tale attività contribuisce a migliorare la conoscenza della situazione epidemiologica delle zoonosi e la comprensione dei meccanismi e delle fonti di contaminazione dei prodotti alimentari.
In particolare, presso il Centro di Riferimento Regionale Patogeni Enterici (CRRPE) dell'IZSUM sono presenti competenze specifiche in grado di effettuare la sierotipizzazione dei batteri enteropatogeni isolati da uomo, alimenti, animali, valutare il pattern di resistenza agli antibiotici, eseguire la tipizzazione molecolare, produrre e raccogliere i dati relativi alla sorveglianza degli enterobatteri a livello regionale e renderli disponibili all'interno della realtà epidemiologica nazionale ed europea.
Figura 1. Laboratori dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Il presente progetto di ricerca corrente è stato finanziato dal Ministero della Salute, Dipartimento della Sanità Pubblica Veterinaria, della Sicurezza Alimentare e degli organi Collegiali per la Tutela della Salute e ha avuto come obiettivo la caratterizzazione di ceppi di Y. enterocolitica isolati da diverse matrici, al fine di evidenziare eventuali correlazioni epidemiologiche tra gli isolati.
Sulla base dei dati raccolti dall'EFSA nel 2013, la yersiniosi si colloca al terzo posto tra le zoonosi più frequentemente notificate con un tasso di notifica generale di 1,92 casi per 100.000 abitanti. Lo stesso report indica la specie "enterocolitica" come quella dominante tra i casi umani (98.66 % dei casi confermati)
Figura 2.
Yersinia enterocolitica e i principali terreni usati per l'isolamento.
A:
Yersinia CIN agar, colonie rosa con centro più scuro (ad "occhio di bue'').
B: Kligler agar (a sinistra) per valutare la capacità di fermentare glucosio e lattosio
e di produrre idrogeno solforato e Christensen agar (a destra) per valutare l'attività ureasica.
Nel periodo di svolgimento di questa ricerca (2014-2016) sono stati notificati al CRRPE 14 isolati di Y. enterocolitica tuttavia, vista la diffusione di questo batterio, è possibile, come peraltro suggerito da numerosi autori, che l'infezione sia fortemente sottostimata e non rilevabile attraverso sistemi di sorveglianza passiva.
In letteratura, ceppi patogeni sono stati recuperati raramente da campioni alimentari, nonostante ciò gli alimenti ed in modo particolare la carne suina sono ancora proposti come principale fonte di yersiniosi intestinale (Latiful et al., 2011).
L'epidemiologia dell'infezione da Y. enterocolitica è complessa e ad oggi rimane ancora scarsamente compresa (Sabina et al., 2011). Gli studi riguardo le caratteristiche epidemiologiche della yersiniosi non sono conclusivi: sono stati sviluppati e riportati in letteratura metodi per la tipizzazione fenotipica e genotipica di ceppi di Y. enterocolitica con lo scopo di identificare i probabili serbatoi d'infezione, i veicoli e le modalità di trasmissione e l'associazione con i casi clinici umani (Botone 2015).
Descrizione degli obiettivi
L'obiettivo della presente ricerca era quello di caratterizzare ceppi di Y. enterocolitica isolati da diverse matrici nel contesto territoriale dell'Umbria e delle Marche, dal 2003 al 2016, al fine di trovare eventuali correlazioni epidemiologiche tra gli isolati, individuare le fonti di infezione che rappresentano un potenziale rischio per la salute e formulare ipotesi in merito alle modalità di trasmissione del batterio all'uomo.
Sintesi dei materiali e metodi
Sono stati raccolti ceppi batterici di Y. enterocolitica conservati nelle criobanche delle unità operative che partecipano al progetto. Dall'inizio del 2015 si è provveduto anche a ricercare Y. enterocolitica in matrici alimentari d'interesse (carni e prodotti a base di carne crudi, formaggi a latte crudo e vegetali crudi di I e IV gamma) conferite al laboratorio di microbiologia degli alimenti dell'Istituto per le analisi di routine, nonché a seguito del Piano Regionale Integrato sulla Sicurezza Alimentare della regione Umbria 2015-2018.
Tutti i ceppi di origine umana provengono da campioni fecali e sono inviati al CRRPE nell'ambito della sorveglianza Enter-Net.
Inoltre, in considerazione dei risultati derivanti da uno studio pilota effettuato nell'ambito della stessa ricerca, è stato progettato ed eseguito un piano di campionamento attivo presso un impianto macellazione di suini, di medie dimensioni, presente sul territorio umbro, nel periodo Giugno 2015 - Aprile 2016.
Il periodo temporale complessivamente coperto dalla ricerca va dal 2003 al 2016.
Gli isolati batterici sono stati analizzati con metodi genotipici (multiplex PCR) per confermare l'attribuzione di specie, per valutare la presenza di geni codificanti per i fattori di virulenza cromosomici e plasmidici e per la determinazione del sierogruppo (Garzetti et al., 2014; Thoerner et al., 2003).
I ceppi di Y. enterocolitica, confermati con metodi molecolari, sono stati ulteriormente caratterizzati fenotipicamente, con metodi biochimici, per la determinazione del biotipo ed è stata inoltre valutata la resistenza agli antimicrobici con il test Kirby-Bauer (Bottone 1999; Wauters et al., 1987).
Figura 3. Principali differenze nei test biochimici tra
Yersinia enterocolitica
appartenente al biotipo 4 (a sinistra) e al biotipo 1A (a destra).
A: attività dell'enzima piraminidasi.
B: idrolisi dell'esculina.
C: attività dell'enzima lipasi.
D: test dell'Indolo.
E: fermentazione di zuccheri).
Tutti i ceppi sono stati infine sottoposti a elettroforesi su gel in campo pulsato (PFGE) con l'enzima di restrizione Not I e la cluster analysis è stata eseguita con il software BioNumerics (CDC Protocol 2013; De Benito et al., 2004).
Figura 4. Elettroforesi su gel in campo pulsato (PFGE).
Da 1 a 11, ceppi di
Yersinia enterocolitica digeriti con l'enzima di restrizione Not I;
C, ceppi di Salmonella Braenderup digeriti con l'enzima di restrizione XbaI usati come controllo.
Prospettive future derivanti dallo studio
I dati della ricerca hanno fornito conoscenze specifiche sui biotipi e sierotipi di Y. enterocolitica isolati da uomo, alimenti, animali e ambiente nel territorio dell'Umbria e delle Marche, in un periodo di circa 13 anni. La tipizzazione molecolare effettuata mediante PFGE ha reso disponibili informazioni d'interesse epidemiologico utili a descrivere la circolazione dei pulsotipi maggiormente presenti sul territorio.
E' stato valutato il grado di omologia dei ceppi isolati e sono stati discussi i fattori che influiscono sulla distribuzione e sulla trasmissione di Y. enterocolitica.
L'analisi filogenetica ha permesso lo sviluppo di un database di profili di restrizione, condiviso con l'Istituto Superiore di Sanità, che potrà essere utilizzato in futuro come supporto epidemiologico per rintracciare possibili fonti di infezione per l'uomo.
Bibliografia
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De Benito I., Cano M. E., Agüero J., García Lobo J. M. (2004). A polymorphic tandem repeat potentially useful for typing in the chromosome of Yersinia enterocolitica. Microbiology, 150:199-204.
Garzetti D., Susen R., Fruth R. A., Tietze E., Heesemann J., Rakin A. (2014). A molecular scheme for Yersinia enterocolitica patho-serotyping derived from genome-wide analysis. International Journal of Medical Microbiology 304(3–4), 275–283.
Latiful Bari M. , Hossain M.A., Isshiki K., Ukuku D. (2011). Behavior of Yersinia enterocolitica in Foods - Journal of Pathogens. Article ID 420732.
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Thoerner P., Bin Kingombe C. I., Bögli-Stuber K., Bissig-Choisat B., Wassenaar T.M., Frey J., Jemmi T. (2003). PCR Detection of virulence gene in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and investigation of virulence gene distribution. Applied and environmental microbiology, 69(3): 1810-1816.
Wauters G., Kandolo K., Janssens M. (1987). Revised biogrouping schema of Yersinia enterocolitica. Contributions to microbiology and immunology. 9:14-21.
Primavilla et al., 2016. Studio preliminare sulle caratteristiche epidemiologiche
di Y. enterocolitica isolata da matrice umana, animale e alimentare. (SPVet.it 99/2016)
