Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 99, Dicembre 2016 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Studio sulle interazioni tra l'infezione da B. hyodysenteriae e il Microbiota nel corso di dissenteria suina per individuare sistemi innovativi di profilassi diretta ed indiretta
Study on the interactions between B. hyodysenteriae infection and the porcine intestinal microbiota, and development of prophylactic methods for the prevention of swine dysentery

Chiara Francesca Magistrali1, Lucilla Cucco1, Francesca Romana Massacci1, Massimo Biagetti1, Carla Sebastiani1, Marta Paniccià1, Monica Cagiola1, Massimo Bugatti1, Giulio Severi1, Carmen Maresca1, Eleonora Scoccia1, Silvio De Luca1, Valentina Betti Sorbelli1, Paolo Pasquali2, Rosanna Drumo2, Michela Tarantino2, Giovanni Pezzotti1


1. Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
2. Istituto Superiore di Sanità



Abstract. Swine Dysentery (SD), a pig infective disease is caused by bacteria belonging to the genus Brachyspira, B. hyodysenteriae and B. hampsonii, a new species which has never been reported in Italy so far. In our Country, the disease is endemic in pig herds, causing relevant economic losses to the pig industry. SD is considered a re-emerging disease in Europe and in Italy, where the spread of multidrug-resistant clones has been recently described. The objectives of this study were to: i) collect information about the epidemiology of B. hyodysenteriae infection in sows and fatteners ii) investigate the association between the composition of the pig gut microbiota and the disease iii) evaluate new diagnostic tests iv) perform a feasibility study for the production of an autogenous vaccine. The data showed a persistent shedding of B. hyodysenteriae from fatteners throughout the production cycle, with or without the presence of diarrhea. In breeders, the prevalence of shedders was very low and we did not find a significant difference between pluriparous and primiparous sows. On farms, the infection was usually restricted to few pens, and spread slowly to the other groups of pigs. The real-time PCR test detected a higher number of shedder sows than culture. Finally, in the fattening herd, we observed a correlation between the composition of the pig gut microbiota and the occurrence of SD.

Riassunto La dissenteria suina (DS) è una malattia infettiva trasmissibile del suino, causata da batteri appartenenti al genere Brachyspira, B. hyodysenteriae e B. hampsonii. In Italia, la DS è causata da B. hyodysenteriae ed è presente in modo endemico e causa di ingenti danni economici negli allevamenti. La DS è considerata una malattia ri-emergente in Europa e in Italia, anche a causa della diffusione di cloni multi-resistenti agli antimicrobici. Nel corso di questo progetto si sono perseguiti diversi obiettivi: i) raccogliere dati relativi alle caratteristiche epidemiologiche della infezione di B. hyodysenteriae in diverse categorie di suini ii) studiare le interazioni tra B. hyodysenteriae e il microbiota intestinale iii) indagare metodi alternativi per la diagnosi dell'infezione e iv) effettuare uno studio di fattibilità per la produzione di un vaccino stabulogeno. I dati raccolti negli animali all'ingrasso hanno mostrato la persistenza della infezione associata o meno a sintomi, per tutta la durata del ciclo produttivo. Nelle scrofe si è osservata una bassa eliminazione batterica e non si sono rilevate differenze statisticamente significative nell'escrezione da scrofe primipare e pluripare. L'infezione sia nei riproduttori che negli ingrassi tende a localizzarsi in alcuni box e a diffondersi molto lentamente nella azienda. Il metodo basato su un test di PCR real time ha rilevato un più elevato numero di scrofe escretrici rispetto all'esame colturale. Infine, nell'allevamento all'ingrasso si è osservata una correlazione tra la composizione del microbiota intestinale e la presenza di DS.



Introduzione
La dissenteria suina (DS) è una malattia infettiva trasmissibile del suino presente in modo endemico in Italia. La malattia è causata da batteri appartenenti al genere Brachyspira, B. hyodysenteriae (Immagine 2) e una specie identificata solo recentemente e ancora non segnalata in Italia, B. hampsonii. Clinicamente, la DS è caratterizzata da una diarrea muco-emorragica che conduce i soggetti colpiti a perdita di peso, disidratazione e cachessia e nei casi più gravi può avere esito letale (Harris, 1999). A partire dal decennio scorso, stata segnalata ovunque nel mondo la comparsa di ceppi a ridotta sensibilità verso gli antimicrobici, fra cui le pleuromutiline, tiamulina e valnemulina (Karlsson 2004, Duinhof 2008), considerate farmaci di elezione per la terapia della DS.
Anche in Italia questo fenomeno è stato descritto da tempo e più recentemente è stato associato alla diffusione di alcuni cloni batterici (Bonilauri 2004, Magistrali 2010, Rugna, 2015) (Immagine 5). La ridotta sensibilità alla terapia antimicrobica creato difficoltà nella gestione di questa malattia negli allevamenti in Europa, mentre negli Stati Uniti si è assistito ad una ricomparsa della DS, forse in seguito a cambiamenti introdotti nella dieta degli animali. In questo contesto, la DS viene oggi considerata una malattia ri-emergente, sia in Europa che negli US (Wilberts 2014). Pertanto, è necessario individuare sistemi alternativi di approccio al problema, preferibilmente di tipo preventivo, poiché l'obiettivo di ridurre l'impiego di antimicrobici nell'allevamento suino appare condiviso da tutti gli operatori della filiera.

Nonostante la dissenteria suina sia una malattia conosciuta da almeno settant'anni, le modalità di trasmissione del batterio negli allevamenti sono scarsamente conosciute, e questo riduce la possibilità di attuare una profilassi diretta dell'infezione (Patterson, 2013). Questo studio ha indagato alcuni aspetti della trasmissione intra-allevamento di B. hyodysenteriae in aziende endemicamente infette. Nei riproduttori, la ricerca ha verificato una possibile relazione tra l'età delle scrofe e l'escrezione batterica. Inoltre, lo studio ha indagato la possibilità di utilizzare la PCR real time per la identificazione delle scrofe infette, con la prospettiva di identificare i soggetti portatori.
Nei suini allo ingrasso, uno studio longitudinale ha permesso di verificare la presenza di animali con infezioni ricorrenti, in grado di eliminare il batterio per tutta la durata del ciclo produttivo, con o senza la presenza di diarrea.
Il rapporto tra composizione della dieta e insorgenza della DS sia in condizioni sperimentali, sia di campo, ha fatto da tempo sospettare una relazione tra composizione del microbiota e comparsa della malattia (Alvarez-Ordonez, 2013). Il microbiota intestinale infatti svolge un ruolo dominante nello sviluppo della risposta immunitaria (Alexander, 2014) e nel conferire resistenza verso le infezioni enteriche (Kamada, 2013). Nel corso di questa ricerca, si sono quindi indagate le relazioni tra l'insorgenza di DS e la composizione del microbiota intestinale del suino, obiettivo perseguito attraverso uno studio osservazionale in allevamenti allo ingrasso endemicamente infetti. Infine, a fronte di esperienze positive segnalate in altri paesi europei, si è effettuato uno studio di fattibilità per la messa a punto di un vaccino stabulogeno per la DS. Infatti B. hyodysenteriae si caratterizza per una lenta crescita in vitro e richiede una atmosfera anaerobia, pertanto la crescita batterica in quantità sufficienti per la produzione di un vaccino richiedeva la messa a punto di un protocollo dedicato. .

Descrizione degli obiettivi della ricerca

1) raccogliere dati relativi alle caratteristiche epidemiologiche della infezione di B. hyodysenteriae in diverse categorie di suini 2) studiare le sue interazioni tra B. hyodysenteriae e il microbiota intestinale 3) indagare metodi alternativi per la diagnosi dell'infezione 4) effettuare uno studio di fattibilità per la produzione di un vaccino stabulogeno.

Sintesi dei materiali e metodi

Obiettivo 1: raccogliere dati relativi alle caratteristiche epidemiologiche della infezione di B. hyodysenteriae in diverse categorie di suini. Si sono indagate due categorie di suini: le scrofe e i suini all'ingrasso. Nelle scrofe, si è indagata la prevalenza in primipare e pluripare, attraverso uno studio trasversale in due allevamenti da riproduzione endemicamente infetti. Nei suini all'ingrasso, si è effettuato uno studio di coorte in due allevamenti da ingrasso in cui nei cicli precedenti si era osservata Dissenteria suina con isolamento di B. hyodysenteriae. In entrambi i casi, la ricerca di Brachyspira spp. è stata effettuata tramite esame colturale, seguito da tipizzazione mediante PCR e, in alcuni casi, da PCR-RFLP (Immagine 6).

Obiettivo 2: studiare le interazioni tra B. hyodysenteriae e il microbiota intestinale. I campioni prelevati all'arrivo degli animali nella coorte di suini all'ingrasso (T0), al momento di massima escrezione di B. hyodysenteriae (T1), in corso di trattamento antibiotico (T2) e due settimane dopo (T3), sono state sottoposte a valutazione del microbiota tramite PCR real time (Braman, 2008).

Obiettivo 3: indagare metodi alternativi per la diagnosi dell'infezione. E' stato effettuato un confronto tra ricerca di Brachyspira in campioni di feci effettuata mediante esame colturale (Magistrali, 2010) e mediante PCR real time (Willems, 2010). La concordanza tra i metodi è stata calcolata mediante test K di Cohen.

Obiettivo 4: effettuare uno studio di fattibilità per la produzione di un vaccino stabulogeno. Sono stati messi a confronto diversi substrati colturali, supplementazioni e modalità di generazione della atmosfera anaerobia per la crescita di B. hyodysenteriae in grossi volumi. Il confronto è avvenuto tramite valutazione della densità ottica del brodo dopo l'incubazione e conta in camera di Burker. E' stato messo a punto e sottoposto a controllo un lotto sperimentale di vaccino. Infine, dopo aver stilato un protocollo per la valutazione dell'efficacia del vaccino in vivo, sono stati valutati i costi relativi alla sperimentazione dello stesso.

Feci di suino colpito da Dissenteria suina (DS) da B. hyodysenteriae
Immagine 1. Feci di suino colpito da Dissenteria suina (DS) da B. hyodysenteriae:
è evidente la presenza di diarrea con sangue, che conferisce il tipico colore rosso scuro alle deiezioni.



solamento di B. hyodysenteriae a partire da campioni di feci
Immagine 2. Isolamento di B. hyodysenteriae a partire da campioni di feci:
la tecnica di Olson, che si basa sull'esecuzione di tagli trasversali nel terreno colturale,
permette di sfruttare le doti di mobilità del batterio per separarlo da altri componenti della flora enterica.


Curve di amplificazione del DNA dopo real time PCR
Immagine 3. Curve di amplificazione del DNA dopo real time PCR.



Coltura pura di B. hyodysenteriae, colorazione blu vittoria
Immagine 4. Coltura pura di B. hyodysenteriae, colorazione blu vittoria, dopo esame in microscopia ottica.



Test della Minima Concentrazione Inibente (MIC)
Immagine 5. Test della Minima Concentrazione Inibente (MIC), eseguito su uno stipite di B.hyodysenteriae.
Il valore di MIC è fondamentale per impostare la terapia, ma richiede uno stipite perfettamente isolato per potere essere eseguito.
Questo fa sì che i tempi analitici siano piuttosto lunghi, circa 15 giorni.



PCR-RFLP. Metodica che permette di distinguere le principali specie appartenenti al genere Brachyspira sppFoto 6
Immagine 6. PCR-RFLP. Questa metodica permette di distinguere le principali specie appartenenti al genere Brachyspira spp. che colonizzano il suino, comprese quelle di dubbia patogenicità, come B. intermedia.



Descrizione delle prospettive future
La ricerca ha permesso di rilevare come in un allevamento all'ingrasso endemicamente infetto, i suini siano in grado di eliminare il batterio per periodi molto prolungati, con e senza presenza di sintomatologia (Immagine 1).
Nel caso da noi osservato, il batterio era multi-resistente e i trattamenti antimicrobici non si sono rilevati efficaci nel contrastare la malattia. E' chiaro come una malattia caratterizzata da un lungo decorso e da sintomi anche in prossimità della macellazione determini un impiego di antibiotici importante in termini quantitativi e prolungato nel tempo. Questi antibiotici vengono somministrati generalmente per via orale, determinando una pressione selettiva sulla flora microbica e successivamente, attraverso i reflui, sulla flora microbica ambientale. Pertanto, la DS è una delle malattie che richiedono un maggiore sforzo in termini di prevenzione anche in una prospettiva di sanità pubblica.


Nel corso di questa ricerca sono emersi alcuni dati che possono essere utili per la profilassi dell'infezione: innanzitutto, sia nei riproduttori che negli ingrassi, si è osservato come la malattia tenda a localizzarsi in alcuni box e si diffonda molto lentamente nella azienda. Questa caratteristica può essere sfruttata per adottare sistemi di de-popolamento parziale per il controllo della DS. In secondo luogo, non è stata osservata una differenza significativa nella escrezione in scrofe pluripare e primipare e i suini all'ingrasso hanno mostrato escrezione batterica associata a diarrea anche a distanza di diverse settimane tra un episodio e l'altro.
A differenza di altre malattie enteriche che colpiscono il suino, la DS non appare quindi ristretta ad un range di età ben definito. Nonostante la PCR real time abbia consentito di individuare un numero maggiore di soggetti escretori rispetto all'esame colturale, le basse prevalenze di escrezione nei riproduttori e il costo elevato di questo metodo non lo suggeriscono come un test adatto per identificare i portatori in corso di piani di eradicazione. La presenza di suini con episodi di DS ricorrenti allo ingrasso sembra suggerire che in corso di DS la immunità si sviluppi con una certa difficoltà, forse in rapporto all'impiego di antimicrobici. Infine, si è osservato una correlazione tra la composizione della flora intestinale e DS. Questo risultato è preliminare basandosi su dati osservazionali, pertanto è necessario confermarlo con studi sperimentali.
Tuttavia la associazione tra composizione del microbiota e DS conferma la possibilità di sviluppare strategie di prevenzione per la DS basate sulla modulazione della flora batterica intestinale.


Ricerca finanziata dal Ministero della Salute, Dipartimento della Sanità Pubblica Veterinaria, della Sicurezza Alimentare e degli Organi Collegiali per la Tutela della Salute: Ricerca corrente IZS UM 13/12 "Studio sulle interazioni tra l'infezione da B. hyodysenteriae e il microbiota nel corso di dissenteria suina per individuare sistemi innovativi di profilassi diretta ed indiretta".
Data inizio progetto: 01.09.2013; Data fine progetto: 30.04.2016


Bibliografia

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OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 99/2016 di SPVet.it



Magistrali et al. Studio sulle interazioni tra l'infezione da <em>B. hyodysenteriae</em> e il Microbiota nel corso di dissenteria suina per individuare sistemi innovativi di profilassi diretta ed indiretta. (SPVet.it 99/2016)
Magistrali et al. Studio sulle interazioni tra l'infezione da B. hyodysenteriae
e il Microbiota nel corso di dissenteria suina per individuare sistemi innovativi di profilassi
diretta ed indiretta. (SPVet.it 99/2016)



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