Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 99, Dicembre 2016 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/indice-spv.html#639
Valutazione dell'immunogenicità di una tossina ß2 purificata ed inattivata ricombinante, da impiegare nella formulazione di un vaccino contro le clostridiosi
Evaluation of immunogenicity of a recombinant, purified and inactivated ß2 toxin, to be used in the formulation of a vaccine against clostridiosis
Martina Pellegrini 1, Anna Serroni 1, Antonio De Giuseppe1, Barbara Chirullo2, Paolo Pasquali2, Giovanni Curina1, Monica Cagiola1, Giulio Severi1
1. Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
2. Istituto Superiore di Sanità
Abstract. The present work allowed to study, develop and optimize in our laboratories the setup and evaluation of immunogenicity of a recombinant protein from Clostridium perfringens. This protein is potentially used in vaccination against the clostridiosis of various animal species. Initially, recombinant toxin was produced in the baculovirus system by synthesis of intracellular forms. The recombinant protein thus obtained was evaluated in vivo on BALB/c mice and it was essentially both non-toxic and immunogenic
Riassunto. Il presente lavoro ha consentito di studiare, sviluppare e ottimizzazione nei nostri laboratori la messa a punto, la produzione e la valutazione dell'immunogenicità di una proteina ricombinante di Clostridium perfringens potenzialmente impiegabile nella vaccinazione contro le clostridiosi delle diverse specie animali. Inizialmente è stata prodotta la tossina ricombinante in sistema baculovirus attraverso la sintesi delle forme intracellulari. La proteina ricombinante così ottenuta è stata valutata in vivo su topi BALB/c e si è sostanzialmente dimostrata sia atossica che immunogena.
Materiali e metodi
Durante le prime fasi del progetto è stato possibile, attraverso lo studio e la ricerca bibliografica, costruire un modello di produzione su piccola scala delle proteine β2 ricombinanti. Successivamente e stata effettuata la purificazione mediante cromatografia per affinità.
Infine si è proceduto alla somministrazione della tossina β2 inattivata in animali da laboratorio per la valutazione della risposta immunitaria mediante tecnica citofluorimetrica della risposta immunitaria innata (F4/80, NK, CD11, CD62L, CD152c) ed acquisita CD4+ e CD8+ CD45RB, CD45RA, CD45R, Foxp3).
La sperimentazione è stata eseguita impiegando 4 gruppi di animali e somministrando differenti combinazioni di molecole così come di seguito sinteticamente riportato:
- gruppo A: proteina β2;
- gruppo B: proteina β2 + adiuvante;
- gruppo C: soluzione fisiologica sterile + adiuvante;
- gruppo D: soluzione fisiologica sterile.
Risultati e discussione
I dati ottenuti hanno mostrato variazioni sulla percentuale delle popolazioni cellulari coinvolte nella risposta immunitaria cellulo-mediata nei quattro gruppi di animali.
L'elaborazione dei dati ha mostrato differenze statisticamente significative nelle popolazioni CD3+ CD4+, CD3+ CD8+, F4/80+ e nella popolazione CD11c tre giorni dopo la stimolazione (T1) confrontando considerando i dati relativi ai gruppi di topi inoculati con la sola tossina β2 (gruppo A) e il relativo gruppo di controllo (gruppo D).
Allo stesso tempo, abbiamo osservato una differenza per quanto riguarda la popolazione F4/80+, CD45+ e CD11c+ tra i topi inoculati con la β2 e adiuvante (gruppo B) e il loro gruppo di controllo (gruppo C). Anche confrontando A con B abbiamo osservato un aumento della percentuale di linfociti appartenenti alla sottopopolazione CD3+ CD4+.
Dieci giorni dopo la stimolazione (T2) è stato possibile evidenziare una differenza significativa tra A e D nella popolazione CD45+ mentre tra B e il suo controllo (C) sono state evidenziate differenze significative relativamente alle sottopopolazioni CD45+ e CD86+. Inoltre, tra i gruppi A e B, sono risultate significative solo le variazioni della sottopopolazione CD86+ e CD11c+. Un mese dopo la stimolazione (T3) è stato invece possibile osservare una differenza significativa nella sottopopolazione CD3+ CD4+ tra il gruppo B e il gruppo C.
Infine, per quanto riguarda le cellule NK possiamo sicuramente affermare che queste mostrano una differenza statisticamente significativa tra gli animali del gruppo A e quelli del gruppo D.
Conclusioni
La proteina β2 oggetto dello studio è risultata priva di tossicità e come tale, quindi, facilmente e direttamente impiegabile in vivo come proteina immunizzante. Un ulteriore vantaggio riscontrato è sicuramente quello rappresentato dalla relativa facilità e velocità di purificazione.
In conclusione possiamo quindi affermare che la proteina ricombinante β2 ha mostrato una buona immunogenicità nei topi BALB/c stimolando efficacemente le popolazioni e sottopopolazioni coinvolte nella risposta immunitaria. Lavoro finanziato dal Ministero della Salute (IZSUM 07/13 RC).
Pellegrini et al., Valutazione dell'immunogenicità di una tossina ß2 purificata ed inattivata ricombinante,
da impiegare nella formulazione di un vaccino contro le clostridiosi. (SPVet.it 99/2016)
