Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 103, Agosto 2017 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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La pasteurellosi del coniglio: caratterizzazione genotipica mediante multiplex PCR e Multilocus sequence typing (MLST) di ceppi di Pasteurella multocida isolati in allevamenti cunicoli industriali, ed indagine sulla correlazione tra genotipo e patogenicità del germe
Rabbit pasteurellosis: genotypic characterization by multiplex PCR and multilocus sequence typing (MLST) of Pasteurella multocida strains isolated in industrial rabbits farms, and investigation of the correlation between genotype and pathogenicity of the germ
Mangili Piermario1, Magistrali Chiara Francesca1, Agostini Luca1, Maresca Carmen1, Perugini Gianni1, Bano Luca2, Lavazza Antonio3
1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Perugia
2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche. Unità Operativa Dipartimentale Officina Farmaceutica - Perugia
3 Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie. Centro di referenza nazionale per le Malattie Virali dei Lagomorfi - Treviso
Abstract. Rabbit pasteurellosis is one of the main health problems of intensive rabbit breeding. Pasteurella multocida is a Gram-negative bacterium, well known as a commensal of the first respiratory tract of several animal species. In particular conditions it is likely to cause the "rabbit respiratory syndrome", a serious multifactorial disease, characterized by a variety of clinical forms: purulent bronchopneumonia, rhinitis, abscesses, metritis, mastitis or, in the worst occurrence, septicemia. The possibility of isolating P. multocida (both from nasal cavities of animals apparently in good health and in deceased animals with clinical symptoms) feed the uncertainty about the role of germ in producing morbid events. In particular. It is uncertain whether there are strains with more pathogenicity than others and although P. multocida acts as a primary disease agent or if exacerbation of clinical forms may be the result of intervention of environmental or managerial predisposing factors. For these reasons, strains of P. multocida have been collected, isolated from healthy and symptomatic animals. Samples were characterized through molecular profile by Multiplex-PCR, aimed at the identification of pathogenicity factors and compared with Multilocus Sequence Typing in order to evaluate any correlation between genotype clusters and germ pathogenicity. Subsequently, the predisposing factors for the onset of the disease (analyzed, by means of a retrospective silica study based on the data of 5 years of necroscopic activity carried out on rabbit carcasses) where evaluated with the aim to point out the possible correlation between: mortality rate attributable to pasteurellosis and seasonality. Finally, an investigation in the field of industrial fattening rabbit farms (where respiratory diseases have been reported) was carried out. This is to verify the involvement of a single clonal strain, or multiple strains simultaneously, in determining morbid episodes. At the same time, an investigation in the breeding sector was conducted, in order to determine whether virulotypes isolated as commensal of the first duct of respiratory system were the same as those responsible for the clinical forms. Concurrently with these activities, histological studies have been carried out on lungs of animals dead for respiratory syndrome. Serological sampling in the fattening sector have been performed with the aim of assessing whether the myxomatosis virus may be a predisposing factor in the onset and / or the exacerbation of the respiratory sindrome. In addition to providing epidemiological information, characterization of isolates associated with certain clinical forms, can be of great help to develope new vaccines for P. multocida, a species characterized by high genetic and antigenic variability
Riassunto. La pasteurellosi del coniglio è una delle principali problematiche sanitarie dell'allevamento cunicolo intensivo.
La Pasteurella multocida è un batterio Gram negativo, normalmente presente come commensale delle prime vie respiratorie di numerose specie animali.
In particolari condizioni è in grado di provocare la "Sindrome respiratoria del coniglio".
Si tratta di una patologia multifattoriale di notevole gravità caratterizzata da svariate forme cliniche: broncopolmonite purulenta, rinite, ascessi, metrite, mastite o, nella peggiore delle ipotesi, setticemia.
La possibilità di isolare indistintamente P. multocida sia dalle fosse nasali di animali apparentemente in buono stato di salute, che da animali deceduti con sintomatologia clinica, alimenta l'incertezza circa il ruolo del germe nel determinismo degli eventi morbosi.
In particolare non è chiaro se esistano ceppi caratterizzati da una maggior patogenicità rispetto ad altri ed anche se P. multocida si comporti come un agente primario di malattia o se l'esacerbazione delle forme cliniche possa essere il risultato dell'intervento di fattori predisponenti di natura ambientale o gestionale.
Per queste ragioni, sono stati collezionati ceppi di P. multocida, isolati da animali sani e sintomatici.
I campioni sono stati caratterizzati sotto il profilo molecolare mediante Multiplex-PCR mirata all'identificazione dei fattori di patogenicità, e confrontati tramite Multilocus Sequence Typing, per valutare eventuali correlazioni tra clusters genotipici e patogenicità del germe.
In seguito sono stati analizzati i fattori predisponenti l'insorgenza della malattia, mediante uno studio retrospettivo in silico basato sui dati di 5 anni di attività necroscopica svolta su carcasse di coniglio con l'obiettivo di valutare l'eventuale correlazione tra: percentuale di mortalità ascrivibile a pasteurellosi e stagionalità.
Infine è stata svolta un'indagine nel settore degli allevamenti cunicoli industriali da ingrasso, a ciclo chiuso, in cui si registrava la presenza di patologie respiratorie.
Ciò al fine di verificare il coinvolgimento di un unico ceppo clonale, o di più ceppi contemporaneamente, nel determinare gli episodi morbosi.
Nel contempo si è svolta un'indagine nel settore riproduttori degli stessi allevamenti per stabilire se i tipi isolati come commensali delle prime vie respiratorie erano i medesimi responsabili delle forme cliniche.
Contestualmente a tali attività, sono stati effettuati accertamenti istologici sui polmoni degli animali deceduti con forma respiratoria e campionamenti sierologici, nel settore ingrasso, con l'obiettivo di valutare se l'eventuale circolazione del virus della myxomatosi potesse rappresentare un fattore predisponente l'insorgenza e/o l'esacerbazione delle forme respiratorie.
Oltre a fornire informazioni di carattere epidemiologico, la caratterizzazione degli isolati associati a determinate forme cliniche può essere di grande aiuto nello sviluppo di nuovi presidi immunizzanti per P. multocida, una specie contraddistinta da grande variabilità genetica e antigenica.
Introduzione
La pasteurellosi da Pasteurella multocida rappresenta una delle principali problematiche sanitarie dell'allevamento cunicolo intensivo ed è in grado di provocare ingenti perdite economiche in questo settore zootecnico. Tale germe, normalmente presente come commensale delle prime vie respiratorie, è in grado in particolari contesti di causare una grande varietà di forme cliniche; i quadri più tipici sono rappresentati da broncopolmonite purulenta, rinite, metrite, ma anche da ascessi, mastite e, nei casi più gravi, forme setticemiche.
Tuttavia la possibilità di isolare indistintamente P. multocida sia dalle fosse nasali di animali in perfetto stato di salute, sia da animali deceduti con sintomatologia di varia natura, alimenta l'incertezza circa il ruolo attribuibile al germe nel determinismo degli eventi morbosi. In altri termini, resta il dubbio se il germe agisca come agente primario di malattia, se esistano stipiti contraddistinti da particolare patogenicità rispetto ad altri o se l'esacerbarsi delle varie forme morbose sia principalmente correlabile all'intervento di fattori predisponenti.
Per queste ragioni, lo scopo di questo progetto è stato di collezionare ceppi di P. multocida isolati da animali sani e sintomatici, caratterizzarli sotto il profilo molecolare mediante un pannello di Multiplex-PCR mirato all'identificazione dei fattori di patogenicità, e confrontarli tramite Multilocus Sequence Typing, per valutare eventuali correlazioni tra clusters genotipici e patogenicità del germe.
Contestualmente a tali attività, sono stati ricercati possibili fattori predisponenti estrinseci di natura ambientali/manageriale ed intrinseci, con particolare riferimento ad infezioni sub-cliniche di natura virale (myxomatosi), in grado di condizionare la patogenesi della malattia.
Materiali e metodi
In funzione degli obiettivi individuati, il progetto è stato organizzato in 4 fasi, di seguito riportate:
Fase 1
La prima fase del progetto si è concretizzata nella creazione di una ceppoteca costituita da isolati di Pasteurella multocida collezionati nel corso dell'attività diagnostica (2004 - 2015) dell'IZSUM e di altri Istituti Zooprofilattici che hanno partecipato al progetto. In totale sono stati collezionati 88 ceppi di P. multocida provenienti da conigli con differenti quadri clinici.
Successivamente sono state messe a punto le metodiche molecolari necessarie per la tipizzazione degli isolati mediante la ricerca dei fattori di patogenicità. In base ad un criterio di economicità, sono stati identificati più fattori simultaneamente mediante la messa a punto di due saggi di Multiplex-PCR di seguito riportati:
- Multiplex PCR per sierotipi capsulari: Al fine di individuare i capsulotipi di Pasteurella multocida è stato ottimizzato un protocollo di Multiplex PCR descritto da Townsend et al. (2001) per l'amplificazione simultanea di geni codificanti i cinque antigeni capsulari (capA, capB, capD, capE, capF) ed un gene specie-specifico (kmt1) comune a tutti i sierogruppi, per la conferma di specie. I target genetici e le condizioni di reazione sono stati ottimizzati sulla base di quanto descritto da Kirsty et al. (2001).
- Multiplex PCR per geni di virulenza: Al fine di individuare i virulotipi di Pasteurella multocida è stato messo a punto un protocollo di Multiplex PCR descritto da Harper et al.,(2015), Ewers et al. (2006) and Atashpaz et al. (2009) per l'amplificazione simultanea di quattro geni di virulenza (hgbB, pfhA, ptbA, toxA). I seguenti target sono associati a meccanismi di adesione batterica (pfhA), alla produzione di tossine necrotiche (toxA) e al metabolismo del ferro (hgbB, ptbA). Le sequenze oligonucleotidiche utilizzate e le condizioni di reazione sono stati ottimizzati sulla base di quanto descritto da Atashpaz et al. (2001).
Fase 2
La seconda fase si è concretizzata nella messa appunto sia della Multi Locus Sequence Typing (MLST), sia della multiplex PCR per la caratterizzazione dei ceppi sulla base dell'antigene lipopolisaccaridico di membrana (LPS).
Degli 88 ceppi di P. multocida originariamente collezionati, ne sono stati selezionati 39 sulla base dell'origine geografica, anno di isolamento (tra il 2004 e 2015) ed organo di provenienza, in maniera tale da garantire la massima variabilità degli stipiti; sono stati aggiunti ulteriori 13 isolati (1924 - 2008) forniti dal Dr. Henrik Christensen del Dipartimento Veterinary Disease Biology della University of Copenhagen.
I 52 ceppi sono stati sottoposti a tipizzazione molecolare sulla base dell'antigene lipopolisaccaridico (LPS), antigeni capsulari, fattori di virulenza (VF) e caratterizzati mediante MLST in collaborazione con il Dr. Henrik Christensen.
La procedure messe a punto in questa fase vengono di seguito riportate:
- Multiplex PCR per la determinazione del genotipo lipopolisaccaridico (LPS)
Il lipopolisaccaride LPS costituisce uno dei componenti principale della superficie cellulare di Pasteurella multocida e consente di classificarla in 16 differenti serovars attraverso la sierotipizzazione di Heddleston. E' stato evidenziato che i 16 serovars di Heddleston esprimono lipopolisaccaridi strutturalmente diversi, consentendo di caratterizzare 8 loci genetici di LPS identificati da 8 genotipi (L1-L8). Il protocollo biomolecolare descritto da Harper et al. (2015) messo a punto, consente di amplificare simultaneamente i geni che codificano per gli 8 antigeni LPS, attraverso l'utilizzo, nella stessa reazione di PCR, di 8 coppie di primers specifiche per i lipopolisaccaridi L1-L8.
- Multilocus Sequence Typing (MLST): L'analisi di Multilocus Sequence Typing (MLST) è stata effettuata in accordo allo schema P. multocida della Rural Industries Research and Development Corporation (RIRDC) (http://pubmlst.org/pmultocida/) (Subaaharan et al., 2010). Il DNA estratto è stato utilizzato per amplificare i loci di 7 geni enzimatici housekeeping in accordo con il protocollo sviluppato da Subaaharan et al.
(2010). In aggiunta al set di primer descritti nel database RIRDC, è stato disegnato un nuovo set di primer zwf al fine di amplificare un frammento di DNA avente lunghezza appropriata per essere riconosciuto nel database: zwf12pmsF(5'-AATCGGTCGTTTGACTGAAC-3') e zsf1pmsR(5'-GTCTTCACCATCAATACTGC-3').
Le condizioni di reazione utilizzate sono quelle descritte da Subahaaran et al (2010). I prodotti di PCR ottenuti sono stati allineati mediante il BioEdit sequence alignment editor software (Hall, 1999). Le sequenze dei sette geni sono state ricercate nel database RIRDC ed è stato loro assegnato il corrispondente Sequence Type (ST).
Tutti gli ST sono stati registrati all'interno del database MLST in RIRDC ed è stato generato un albero filogenetico mediante ClustalX (Thompson et al., 1997) e presentato graficamente mediante
MEGA4 (Tamura et al., 2007).
- Analisi MLST: Le sequenze ottenute come files ABI (.seq) sono state analizzate mediante l'utilizzo del software CLC Main Workbench (www.clcbio.com) disponibile presso il dipartimento Veterinary Disease Biology della University of Copenhagen. Tale software ha un modulo MLST che si interfaccia con il P. multocida Rural Industries Research and Development Corporation (RIRDC) MLST database e che consente di ottenere direttamente il sequence type (ST) dall'analisi delle combinazioni alleliche dei 7 loci. Alcuni ceppi presentavano dei sequence type già presenti nel database mentre altri presentavano nuove sequenze alleliche per alcuni dei 7 loci analizzati. Le nuove sequenze sono state verificate e quindi sono stati assegnati nuovi STs.
- Analisi statistiche: Le associazioni fra organo di origine e la distribuzione dei tipi capsulari, fattori di virulenza, genotipo lipopolisaccaridico e complessi clonali sono state valutate utilizzando il test Chi-quadrato.
Lo stesso test è stato utilizzato per studiare le associazioni fra complessi clonali e tipi capsulari e fra complessi clonali e fattori di virulenza. Sono stati considerati significati i risultati con P < 0.05.
Fase 3
Questa fase del progetto si è concretizzata in uno studio retrospettivo condotto analizzando i risultati degli ultimi 5 anni di attività necroscopica (2012-2016) svolta sulle carcasse di coniglio conferite presso i laboratori dell'IZSUM con finalità diagnostica. L'obiettivo è stato quello di valutare la correlazione tra i referti diagnostici che identificavano Pasteurella multocida come patogeno principale e la stagionalità.
E' stata effettuata un'analisi descrittiva dei dati analizzando i campioni testati e i campioni risultati positivi per P.multocida in relazione agli anni e ai mesi in cui è sopraggiunta la morte degli animali.
L'ipotesi nulla di una assenza di associazione tra la stagione (inverno, primavera, estate e autunno) e l'isolamento di P. multocida da campioni di coniglio nel corso dell'attività diagnostica è stata valutata mediante Test Chi quadrato di Pearson. Successivamente, la associazione tra ciascuna stagione e l'isolamento di P. multocida è stata quantificata mediante calcolo dell'Odds Ratio (OR), prendendo come valore di riferimento la stagione invernale. Il calcolo è stato effettuato mediante il software MEDICALC disponibile on-line (https://www.medcalc.org/calc/odds_ratio.php). In entrambi i casi, la soglia della significatività è stata posta a p?0.05.
Fase 4
L'ultima fase del progetto ha previsto l'identificazione e tipizzazione ceppi di P. multocida isolati in allevamenti cunicoli in corso di malattia respiratoria in soggetti all'ingrasso (tra i 30 e gli 80 giorni di età). L'obiettivo è stato quello di verificare se nell'ambito dello stesso allevamento la forma morbosa fosse riconducibile alla circolazione di un unico ceppo clonale o a ceppi clonali differenti, ed eventualmente stabilire se lo stesso virulotipo fosse presente nei riproduttori come commensale delle prime vie respiratorie, avvalorando pertanto l'ipotesi che le fattrici possano giocare un ruolo fondamentale nel determinismo della forma morbosa, trasmettendo il patogeno alla nidiata prima dello svezzamento.
A questo proposito sono stati selezionati 3 allevamenti industriali a ciclo chiuso che presentavano mortalità e forme cliniche riconducibili a malattia respiratoria in soggetti di età compresa fra i 45 e 70 giorni nel reparto ingrasso.
Gli animali deceduti presso ciascun allevamento sono stati sottoposti ad indagini necroscopiche, seguiti dai relativi accertamenti batteriologici ed istologici nei casi in cui macroscopicamente si evidenziavano lesioni ascrivibili a polmoniti e broncopolmoniti purulente, pleuriti fibrino-purulente, piotorace ed ascessi polmonari.
Parallelamente all'indagine sulle forme respiratorie condotta nel reparto ingrasso, presso ciascun allevamento sono stati eseguiti 31 tamponi nasali nel reparto fattrici, per un totale di 93 campioni.
Infine è stata valutato il possibile coinvolgimento del virus della myxomatosi quale fattore predisponente nel determinismo ed esacerbazione delle forme respiratorie sostenute da P. multocida (myxomatosi amyxomatosa). A questo proposito, contestualmente ai sopralluoghi per l'esecuzione dei tamponi nasali sulle fattrici, sono stati prelevati dai conigli del reparto ingrasso di ciascuno degli allevamenti oggetto di studio 20 campioni di sangue, per un totale di 60 campioni.
I sieri prelevati sono stati sottoposti ad accertamenti sierologici nei confronti del virus della Myxomatosi mediante kit c-ELISA home-made prodotto presso Centro di Referenza Nazionale per le Malattie Virali dei Lagomorfi dell'IZS della Lombardia ed Emilia Romagna (Lavazza et al., 2013; Botti et al., 2007; Lavazza et al., 2004).
Risultati
Fase 1
In totale sono stati collezionati 88 ceppi di P. multocida provenienti da conigli con differenti quadri clinici. Ciascun ceppo è stato caratterizzato sulla scorta del sierogruppo capsulare (A, B, D, E, F) ed in relazione alla presenza dei geni di virulenza toxA, tbPA, hgbB, pfhA.
Tutti gli isolati esaminati sono risultati positivi al gene kmt1 comune a tutti i sierogruppi ed utilizzato per la conferma di specie.
Lo studio condotto sugli 88 ceppi collezionati mostra una grande variabilità fra gli isolati di P. multocida, e tale eterogeneità viene riportata anche da altri autori (Stahel et al.,2009).
In totale sono stati identificati prevalentemente capsulotipi A, e in minor misura capsulotipi D e capsulotipi F; il capsulotipo E non è mai stato identificato mentre il capsulotipo B è stato identificato in una sola circostanza. Tale dato trova riscontro nella letteratura scientifica, giacché è stato dimostrato che la pasteurellosi nei conigli è causata principalmente dal tipo capsulare A e, in misura minore, dal tipo capsulare di tipo D ed F (Chengappa et al., 1982; Kawamoto et al., 1990; Dabo et al., 1999).
Per quanto concerne i fattori di virulenza, la maggioranza dei ceppi presentava un solo fattore di patogenicità e sono stati identificati prevalentemente geni hgbB e geni pfhA. In soli 3 casi non è stato rilevato alcun target di patogenicità, mentre il gene toxA non è stato mai identificato.
Fase 2
Un totale di 52 ceppi sono stati sottoposti a tipizzazione molecolare sulla base dell'antigene lipopolisaccaridico (LPS), antigeni capsulari, fattori di virulenza (VF) e caratterizzati mediante MLST.
Per quanto concerne i tipi capsulari la maggior parte dei ceppi è risultata positiva al capsulotipo A e in minor misura al capsulotipo D ed F, mentre i capsulotipi B ed E non sono mai stati identificati; i fattori di virulenza maggiormente individuati sugli isolati sono pfhA e hgbB, mentre nessun ceppo è risultato positivo per i geni toxA e tbpA. Nei ceppi forniti dal Dr. Henrik Christensen non è stato possibile identificare alcun VF.
Per quanto riguarda la determinazione del genotipo lipopolisaccaridico soltanto i genotipi L3 e L6 sono stati identificati in questo studio.
L'analisi del MLST ha evidenziato che 23 isolati sono risultati appartenenti a 7 STs già presenti nel database P. multocida RIRDC MLST, mentre i rimanenti 29 isolati non erano riferibili ad STs già esistenti. I differenti STs identificati durante lo studio sono risultati appartenere principalmente a 3 complessi clonali (CC) che includevano la maggior parte di tutti i ceppi.
Non è stata riscontrata alcuna associazione statisticamente significativa tra l'organo di provenienza dei ceppi e la distribuzione dei tipi capsulari, fattori di virulenza, genotipi lipopolisaccaridici e gli STs.
Fase 3
Nel quinquennio 2012/2016 sono state sottoposte ad accertamento diagnostico un totale di 1336 carcasse di coniglio; il numero di esami anatomo-patologici eseguiti è risultato uniformemente distribuito negli anni considerati. Diversamente, analizzando i dati cumulativi delle necroscopie eseguite nei diversi mesi dell'anno, il numero degli accertamenti eseguiti è apparso piuttosto altalenante, con una marcata flessione nella stagione estiva.
Il totale degli isolamenti di Pasteurella multocida è risultato essere 280. Il numero di isolamenti è risultato difforme nel quinquennio, sia considerando le singole mensilità cumulative, sia considerando le stagionalità. Se si considera la percentuale di positività per P. multocida rispetto al numero dei capi analizzati e si considera la stagionalità, appare evidente che il periodo primaverile ed estivo risultano essere quelli in cui si registra la percentuale di casi positivi per pasteurellosi più elevata. L'ipotesi nulla di un'assenza di associazione tra stagione e isolamento di P. multocida è stata scartata sulla base dell'esito del chi-quadro (p=0,00001). In particolare, la stagione primaverile e quella estiva, a differenza di quella autunnale, sono state individuate come fattori di rischio per l'isolamento di P. multocida.
Fase 4
Nel corso dell'indagine condotta presso 3 allevamenti cunicoli con problematiche respiratorie riferibili a Pasteurella multocida sono stati eseguiti 93 accertamenti autoptici, 2/3 dei quali hanno evidenziato quadri anatomo-patologici macroscopicamente riconducibili a polmoniti e broncopolmoniti purulente, pleuriti fibrino-purulente, piotorace ed ascessi polmonari. Gli esami batteriologici condotti sui polmoni hanno portato all'isolamento di 39 ceppi di Pasteurella multocida. Per quanto concerne gli esiti degli accertamenti batteriologici da tampone nasale eseguiti sulle fattrici, sono stati isolati un totale di 72 ceppi di Pasteurella multocida.
Sia i ceppi provenienti dai casi clinici che quelli ottenuti dai tampone nasale sono stati sottoposti a tipizzazione molecolare sulla base dell'antigene lipopolisaccaridico (LPS), antigeni capsulari e fattori di virulenza (VF).
Nel complesso sono stati isolati 111 ceppi di P. multocida. Gli unici capsulotipi isolati sono stati A, D ed F. I capsulotipi B ed E non sono mai stati identificati. Lo studio condotto ha confermato il dato presente in letteratura, vale a dire che i ceppi maggiormente diffusi nella specie cunicola appartengono ai capsulotipi A, D. Tuttavia, la nostra indagine ha evidenziato un possibile ruolo del capsulotipo F nella eziologia della pasteurellosi del coniglio.
Altro dato di particolare importanza è stato l'isolamento di ceppi privi di antigeni capsulari in 11 casi. Poiché la capsula rappresenta un'importante fattore di patogenicità del germe è interessante sottolineare che tutti gli isolati provenivano da tamponi nasali di animali asintomatici.
Per quanto concerne i fattori di patogenicità, la maggior parte dei ceppi è risultato positivo per il solo gene pfhA, mentre un piccola percentuale è risultata HgbB+; l'associazione dei due fattori di patogenicità si è verificata in un numero esiguo di casi. I geni tbpA e toxA non sono mai stati identificati.
La caratterizzazione sulla base del genotipo LPS ha evidenziato che la quasi totalità dei ceppi erano L3 ed L6; un piccola percentuale è risultata appartenente ai genotipi L5 ed L7; quest'ultimo dato rappresenta una novità rispetto alle tipizzazioni della fase precedente della ricerca.
Il capsulotipo A è risultato nella quasi totalità dei ceppi analizzati associato al gene pfhA ed al genotipo L3, similarmente al capsulotipo F, risultato sempre associato al genotipo L3 e al gene pfhA. La maggior variabilità genotipica è stata osservata con il capsulotipo D, associato al genotipo L3, L6, L5, L7 ed ai geni pfhA, hgbB o entrambi contemporaneamente.
Per ciò che concerne gli accertamenti istologici (n.20), condotti mediante campionamenti multipli di tessuto polmonare, l'osservazione dei preparati ha evidenziato una ricca essudazione fibrino eterofilica endo-brionchiale e bronchiolo-alveolare associate a eventi emorragici multifocali. In alcuni preparati si rinveniva interessamento anche pleurico. I quadri istologici nel complesso sono risultati sempre compatibili con bronco-polmonite acuta eterofilica e fibrinosa diffusa di origine batterica. Nessun campione ha mostrato lesioni compatibili con una forma di mixomatosi amixomatosa (poxless myxomatosis).
Infine per quanto riguarda l'indagine sierologica, nessun campione di siero prelevato è risultato positivo per la presenza di anticorpi nei confronti del virus della myxomatosi del coniglio.
Conclusioni e prospettive future
Lo studio condotto ha messo in evidenza una marcata eterogeneità della popolazione di P. multocida nel coniglio. La caratterizzazione molecolare dei ceppi mediante Multiplex PCR per la determinazione del capsulotipo, virulotipo, genotipo lipopolisaccaridico (LPS) e la messa a punto della Multilocus Sequence Typing (Fase 1e 2) si sono dimostrati strumenti fondamentali per la selezione degli isolati utilizzabili per l'allestimento di vaccini stabulogeni.
Tale considerazione emerge dall'osservazione di ceppi con potenzialità patogenetiche superiori rispetto ad altri. Peraltro, come emerso nell'indagine svolta presso le tre aziende cunicole con forme morbose riconducibili a Pasteurellosi, spesso i focolai di malattia sono caratterizzati dalla contemporanea circolazione di cloni batterici differenti con profili di genetici diversi.
Questo dato sottolinea l'importanza di un corretto iter diagnostico e di una completa caratterizzazione degli isolati prima dell'allestimento dei vaccini, per evitare che i ceppi inclusi nel vaccino non risultino del tutto rappresentativi rispetto agli stipiti responsabili di malattia. Alla luce di ciò la profilassi immunizzante, che fino ad oggi ha prodotto risultati contrastanti nel settore cunicolo, potrebbe divenire una strategia realmente efficace per il controllo della pasteurellosi, consentendo la riduzione dell'utilizzo di antimicrobici che fino ad ora hanno costituito il principale strumento per la risoluzione della problematica.
Per quanto concerne l'analisi dei fattori condizionanti di natura ambientale/gestionale (Fase 3), è emerso che le stagioni primaverile e quella estiva, a differenza di quella autunnale e invernale rappresentano fattori di rischio per l'isolamento di P. multocida. Tale studio tuttavia, basato su di un indagine di tipo passivo, risulta comunque soggetto a molteplici criticità: ad esempio il campionamento non è randomizzato ed è probabile che in alcune stagioni siano stati effettuati più conferimenti per pasteurellosi per motivi diversi rispetto alla reale incidenza della malattia. Inoltre è possibile che i conferimenti di campioni da parte di allevamenti di tipo familiare abbiano influenzato il dato, giacché in questa tipologia di allevamento non esistono, contrariamente a quanto accade in quelli di tipo intensivo, sistemi di controllo dell'aerazione e delle temperature (ventilazione forzata, cooling). Ciò nonostante, in relazione ai risultati ottenuti, è verosimile ipotizzare che gli sbalzi termici giornalieri, tipici della stagione primaverile, e le elevate temperature medie della stagione estiva, contribuiscano ad esacerbare il problema della pasteurellosi.
Analizzando infine gli esiti delle tipizzazioni molecolari del settore riproduttori e del settore ingrasso nelle tre Aziende (Fase 4), oltre alla variabilità genotipica riscontrata in base alla provenienza dei ceppi (tamponi nasali vs forme cliniche), si osserva che tutti i ceppi responsabili di malattia sono stati isolati anche dalle fosse nasali dei riproduttori; il dato sembra alimentare l'ipotesi che i riproduttori possano fungere da serbatoio per la trasmissione dell'infezione alla nidiata prima dello svezzamento.
Tale riscontro tuttavia dovrebbe essere avvalorato da una più approfondita caratterizzazione degli isolati, giacché è stato osservato che ceppi con medesimi fattori di patogenicità possono appartenere a genotipi differenti e quindi tale evenienza automaticamente farebbe decadere l'ipotesi sopracitata. D'altra parte è anche vero che in una delle tre Aziende alcuni degli stipiti responsabili di malattia nei soggetti all'ingrasso non hanno trovato un corrispettivo clone nei tamponi nasali delle fattrici.
È possibile che il ceppo patogeno non sia stato riscontrato perché circolava con bassi tassi di prevalenza nei riproduttori. Sarebbe quindi interessante e indagare ulteriormente il ruolo dei riproduttori e analizzare altre possibili fonti di contagio.
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