Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 103, Agosto 2017 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Nuove matrici target nel controllo dei trattamenti anabolizzanti in bovini
New target matrices to control anabolic treatments in cattle


Roberta Galarini1, Simone Moretti1, Giorgio Saluti1, Giulio Severi2, Rosanna Rossi1, Sara Romanelli1, Giancarlo Biancotto3, Roberto Stella3, Elena Bozzetta4, Tiziana Cannizzo5



1 Centro Sviluppo e Validazione Metodi. Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Perugia
2 Unità Operativa Dipartimentale Officina Farmaceutica. Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Perugia
3 Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie - Legnaro (PD)
4 Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d'Aosta - Torino
5 Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università degli Studi di Torino - Torino


Abstract. European Union banned anabolic treatments in livestock through Directive 88/146/CEE, considering them dangerous for public health. Despite the well-known international disputes, that prohibition has been reiterated so far. The traditional analytical methods are essential to evaluate human exposition to these compounds and to support regulatory developments; however they are criticized because of the low percentages of not-compliant samples (which are assumed as unreasonably low) in the face of the large number of samples analyzed in all the European territory. That could also be connected to the matrices traditionally sampled within these official controls, i.e. urine, in which the elimination times are short (2-5 days). In this context, bovine bile, which is able to bio-concentrate some anabolizing agents (e.g. steroids and zeranol), may be a good alternative matrix to discover possible illicit treatments in farm. In this work, an innovative multiclass screening method based on liquid chromatography coupled to high-resolution tandem mass spectrometry has been developed and validated. After the validation study, the method demonstrated to be able to detect at the levels of interest more than 50 substances belonging to groups A1, A3,A4, A5 A6 and B2f listed in the Annex I of Directive 96/23/EC

Riassunto. Con la Direttiva 88/146/CEE l'Unione europea ha vietato i trattamenti anabolizzanti in allevamento a scopo di ingrasso ritenendoli un pericolo per la salute pubblica. Nonostante le ben note controversie internazionali, questo divieto è stato reiterato fino ad oggi. I metodi analitici tradizionali sono fondamentali per valutare l'esposizione umana a questi composti e per supportare l'evoluzione normativa, tuttavia essi vengono sempre più criticati in quanto, a fronte dei numerosi controlli effettuati annualmente in tutto il territorio dell'Unione europea, si riscontrano percentuali di positività (campioni non conformi) ritenute irrealisticamente basse. Questo evento potrebbe essere in parte anche dovuto alle matrici tradizionalmente campionate all'interno dei Piani Nazionali, in particolare l'urina in cui i tempi di escrezione sono notoriamente brevi (2-5 giorni). In questo contesto, la bile, vista la sua comprovata capacità di bio-concentrare alcune sostanze anabolizzanti (ad esempio, steroidi e zeranolo), potrebbe rappresentare una matrice alternativa per integrare al macello i controlli convenzionali, al fine di aumentarne l'efficacia. In questo lavoro si è quindi sviluppato e validato un metodo di screening innovativo di tipo multiclasse nella bile bovina basato sulla tecnica della cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem in alta risoluzione (LC-HRMS/MS). Dopo lo studio di validazione, il metodo ha dimostrato di essere in grado di rilevare ai livelli di interesse oltre cinquanta sostanze appartenenti ai gruppi A1, A3, A4, A5, A6 e B2f elencati nell'Allegato I della Direttiva 96/23/CE



Introduzione
Già dalla fine degli anni ottanta, con la Direttiva 88/146/CEE l'Unione Europea ha vietato i trattamenti anabolizzanti negli allevamenti ritenendoli un pericolo per la salute pubblica (Direttiva 88/146/CEE). Tale divieto persiste ancora oggi, nonostante le polemiche e le guerre commerciali ("Beef hormone controversy", Wikipedia). Sebbene i metodi analitici tradizionali siano fondamentali per valutare l'esposizione umana a questi composti e per supportare l'evoluzione normativa, essi vengono frequentemente criticati in quanto, a fronte dei numerosi controlli ufficiali effettuati annualmente in tutto il territorio dell'Unione europea, si riscontrano percentuali di positività ritenute irrealisticamente basse.
Ciò può essere dovuto a molteplici cause, ma è ben noto da studi in allevamento che dopo un trattamento, i residui della sostanza o delle sostanze somministrate sono rilevabili al massimo per 2-3 giorni nell'urina, la matrice tradizionalmente più utilizzata nel controllo delle sostanze vietate. Inoltre la prassi di utilizzare anche dei cocktails di molecole a basse concentrazioni relative ostacola ulteriormente la possibilità di misurarne i residui.

Per superare questa situazione alcuni gruppi di ricerca hanno proposto approcci cosiddetti "untargeted" che vanno a valutare l'effetto di una sostanza, piuttosto che a determinare il residuo della stessa. Tali approcci si basano sulle cosiddette tecniche "omiche" (proteomica, metabolomica, trascrittomica etc). Nella stessa direzione punta anche l'introduzione dei controlli istologici all'interno del Piano Nazionale Residui italiano. Come premesso, l'utilità di queste strategie risiede nella possibilità di misurare un effetto senza dover conoscere esattamente l'eventuale sostanza o sostanze che l'hanno causato che è quanto di solito avviene per il doping.
Tuttavia essi hanno un valore puramente di screening e possono essere efficaci nell'indirizzare i controlli tradizionali verso certi allevamenti (sospetti) piuttosto che altri. Inoltre, le tecniche "omiche" sono piuttosto complesse da attuare e, al momento, non sembrano alla portata dei laboratori di routine, poiché richiedono strumentazioni avanzate, competenze di bioinformatica e banche dati per il confronto tramite elaborazioni statistiche multivariate. L'esame istologico, invece, è sicuramente semplice da un punto di vista tecnico, ma non fornisce dati attendibili per tutte le sostanze utilizzate nei trattamenti anabolizzanti e rimane comunque sempre un test di screening.

I punti critici nel controllo delle sostanze anabolizzanti e le principali strategie per il loro superamento sono riassunti nello schema in Figura 1. In Figura 1 non sono considerati i problemi legati alla rilevazione di trattamenti illeciti effettuati con steroidi naturali (principalmente estradiolo, progesterone e testosterone) che pongono ovviamente sfide ancora più complesse per discriminare gli steroidi naturalmente presenti (endogeni) da quelli di origine esogena, ovvero frutto del trattamento illecito.

Figura 1. Punti critici nel controllo analitico delle sostanze anabolizzanti usate in allevamento e possibili strategie di miglioramento
Figura 1. Punti critici nel controllo analitico delle sostanze anabolizzanti usate in allevamento e possibili strategie di miglioramento
Figure 1. Critical points in the analytical control of anabolic substances used in breeding and possible improvement strategies


Una delle possibilità per superare il problema legato ai tempi brevi di eliminazione delle sostanze somministrate nell'urina è quella di usare matrici cosiddette "alternative", ovvero matrici capaci di bio-accumulare il principio attivo (o un suo metabolita) del trattamento per più giorni di quanto non succeda nelle matrici tradizionali.
Un esempio di successo è stata l'introduzione della retina per il controllo dei trattamenti con beta-agonisti, un gruppo di molecole anabolizzanti molto abusate negli anni novanta (Brambilla et al. 2000). Solo per citare uno dei tanti casi, analizzando la retina di suino, Pleadin et al. hanno rilevato la presenza di residui di clenbuterolo a distanza di ben 45 giorni dalla somministrazione (Pleadin et al., 2011).

Analogamente, altri studi in allevamento hanno dimostrato che alcuni steroidi, così come lo zeranolo, vengono bio-concentrati nella bile bovina e possono essere quindi rilevati a distanza di molti giorni dall'interruzione della somministrazione (Chichila et al. 1988; McEvoy et al. 1998; McEvoy et al. 1999; Lega et al. 2017). Siccome organizzare sperimentazioni "in vivo" nei bovini è molto complesso e costoso, non è noto se la bile possa bio-concentrare anche altri anabolizzanti, oltre a quelle appartenenti ai gruppi A3 e A4, come ad esempio i beta-agonisti (A5).
Affrontando il problema da un altro punto di vista, un modo per migliorare l'efficacia dei controlli è sicuramente quello di aumentare il numero di analiti simultaneamente testati attraverso lo sviluppo di procedure di screening non solo multiresiduo, ma anche multiclasse (Figura 1). Infatti attualmente in molti laboratori di routine i singoli campioni prelevati dalle autorità competenti vengono analizzati per una sola molecola compresi i suoi evantuali metaboliti (nandrolone, trenbolone, etinilestradiolo etc..) o al massimo per una classe di molecole (beta-agonisti, corticosteroidi etc.).

Questo è quello che viene anche indicato nel Piano Nazionale Residui del nostro paese. E' evidente che, al di là delle performances dei singoli metodi analitici, se la sostanza applicata nell'eventuale trattamento non fosse inclusa tra quelle "cercate", non verrebbe rilevata. Inoltre, questo "modus operandi" comporta un altro inconveniente, ovvero la necessità di sviluppare, validare e accreditare decine di test diversi per riuscire a determinare l'intera gamma di sostanze vietate elencate nell'allegato I della Direttiva 23/96 (Tabella 1).

Tabella 1. Allegato I della Direttiva 96/23/CEa
Table 1. Annex I to the Directive 96/23/CEa
Table 1.

Va da sé che questo comporta tempi e costi elevati. Le recenti evoluzioni tecnologiche, soprattutto nel campo degli analizzatori in spettrometria di massa, hanno reso possibile via via approcci in grado di determinare decine di molecole simultaneamente, anche appartenenti a classi chimicamente diverse, ovvero con proprietà chimico-fisiche disomogenee.
Va detto, però, che al contrario di altri settori analitici, nel campo delle sostanze vietate (Tabella 1) questo approccio stenta a decollare. Probabilmente questo accade sia perché l'interesse in questo caso riguarda quasi esclusivamente l'ambito del controllo ufficiale, sia perché i livelli e le matrici implicate rendono questa sfida analitica molto più complessa.

A riprova di ciò, se da un lato, ad esempio, sono numerose le ricerche pubblicate che riportano lo sviluppo di metodi multiclasse per la determinazione di residui di pesticidi e, più recentemente, anche di farmaci veterinari autorizzati (Mainero Rocca et al. 2017), scarsi sono gli studi riguardanti metodi multiclasse in grado di determinare decine di sostanze vietate appartenenti a classi diverse (León et al. 2012; Leporati et al. 2012).
Alla luce di quanto premesso, questa ricerca si è proposta, sulla falsariga della linea già intrapresa con successo in quella precedente (RC IZSUM 022012), di sviluppare e validare una procedura di screening in grado di evidenziare simultaneamente una vasta gamma di sostanze vietate in una matrice alternativa, ovvero la bile.

Materiali e metodi

Materiali e reagenti
L'elenco dei materiali di riferimento (standard analitici) impiegati e quello degli standard interni è riportato in Tabella 2, unitamente all'indicazione dei vari fornitori. La beta-glucuronidasi da H. pomatia (codice G0876) è stata fornita dalla Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Tabella 2. Elenco degli analiti oggetto del metodo e degli analoghi marcati utilizzati
Table 2. List of the analytes and the mark, used in the method


Le colonnine SPE OASIS HLB (200 mg/6 mL) sono state acquistate da Waters Corporation (Milford, MA, USA) e quelle ISOLUTE NH2 (500 mg/6 mL) da Biotage (Uppsala, Sweden). Infine, le colonnine Strata-X-C dalla Phenomenex (Torrance, CA, USA). I filtri Millipore in PTFE da 0.2 µm sono stati forniti dalla Merck S.p.a.(Vimodrone, Milano, Italia).
L'acqua Ultra-pura (>18 M -cm) è stata prodotta con un sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Preparazione del campione Le fasi principali del trattamento del campione sono riportate nello schema di Figura 2.

Figura 2. Schema di trattamento del campione
Figura 2. Schema di trattamento del campione
Figure 2. Sample treatment scheme


Validazione del metodo
Lo studio di validazione è stato effettuato in base a quanto prescritto per un metodo di screening dalla Decisione 2002/657/CE (Decisione 2002/657/CE) e dalla specifica Linea Guida emanata successivamente dai Laboratori di Riferimento dell'Unione Europea (Community Reference Laboratories, 20/01/2010). Con la procedura ottimizzata sono stati quindi analizzati 59 campioni di bile bovina appartenenti ad animali diversi. Gli stessi campioni sono stati parallelamente testati dopo additivazione ai livelli di interesse.

Prova interlaboratorio
Al termine della fase di sviluppo e validazione del metodo di screening, alcuni tra i campioni di bile testati presso l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche che ha sviluppato il metodo sono stati analizzati presso l'Istituto Zooprofilattico delle Venezie (sede di Padova) con la stessa procedura, tranne piccole modifiche nella parte strumentale resesi necessarie nel trasferimento.

Condizioni strumentali
Le analisi sono state effettuate mediante un sistema HPLC Ultimate 3000 - Thermoscientific (San Jose, CA, USA) dotato di un rilevatore di massa Q-Exactive (Thermoscientific). La separazione cromatografica è stata ottenuta mediante eluizione in gradiente e, viste le differenti proprietà delle varie classi di analiti, è stato necessario eseguire sia una corsa in modalità negativa (per stilbenici, RALs e cloramfenicolo) che una in modalità positiva (per le restanti classi di composti).

Risultati
In Figura 3 sono riportate le strutture di alcuni analiti rappresentativi di ciascuna classe di sostanze oggetto del metodo. Dopo lo sviluppo delle condizioni strumentali (cromatografia e parametri dell'analizzatore di spettrometria di massa), si è affrontata una lunga ed articolata fase per l'ottimizzazione del trattamento del campione a partire dal protocollo precedentemente sviluppato per la matrice urina (RC IZSUM 0022012).

Figura 3. Strutture di alcuni analiti rappresentativi delle classi determinate con il metodo proposto
Figura 3. Strutture di alcuni analiti rappresentativi delle classi determinate con il metodo proposto
Figure 3. Structures of some analytes representing the classes determined through the method proposed


Il trattamento del campione è un aspetto fondamentale in quanto i livelli da raggiungere (poche parti per miliardo) e la complessità dei fluidi biologici comportano la ri-concentrazione negli estratti finali di numerose sostanze interferenti endogene che possono compromettere sia la selettività che i limiti di rilevazione del metodo. Una scarsa selettività inficia l'applicabilità dello screening stesso, non solo per quanto riguarda i risultati falsi negativi che comunque devono obbligatoriamente rimanere sotto il 5% (Decisione della Commissione 2002/657/CE), ma anche per il tasso dei falsi positivi.
Pur non essendo stabilita una soglia, va da sé che una elevata percentuale di falsi positivi vanifica l'utilità stessa di un test di screening. Gli esperimenti effettuati in questo studio hanno permesso di migliorare quanto già sviluppato per il trattamento dell'urina bovina, tanto che poi lo stesso protocollo schematizzato in Figura 2 è stato applicato con successo anche all'urina migliorando le performances analitiche della procedura sviluppata all'interno della Ricerca Corrente RC IZSUM 002 2012.

Lo studio di validazione è stato disegnato in accordo con le normative e le Linee Guida emanate dell'Unione europea (Decisione della Commissione 2002/657/CE; CRLs 20/01/2010). Il metodo è risultato idoneo per lo screening di ben 57 sostanze vietate (o assimilabili) nella bile bovina al livello di interesse stabilito.
Infine, per valutare la trasferibilità che è uno dei requisiti dei metodi innovativi che si sviluppano all'interno della Ricerca Corrente finanziata dal Ministero della Salute, alcuni campioni di bile, analizzati presso il laboratorio IZSUM di Perugia, sono stati rianalizzati presso il laboratorio IZSVE di Padova. Va precisato che l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie è dotato dello stesso strumento in nostro possesso (LC-Q-Exactive).
Dopo il trasferimento della SOP sviluppata a Perugia, nell'arco di una settimana, è stato possibile riprodurre perfettamente il metodo e ottenere risultati sovrapponibili.

Discussione e prospettive future
Per la scelta delle molecole oggetto del metodo ci si è basati su quelle previste nel Piano Nazionale Residui. Negli obiettivi del progetto si era individuato un pacchetto di anabolizzanti appartenenti alla categoria A3 (steroidi) e A4 (lattoni dell'acido resorcilico). Come osservato in esperimenti precedenti, l'inserimento del gruppo dei tireostatici (A2) non era ritenuto un obiettivo realistico, date le loro proprietà chimico-fisiche, ma per gli altri sottogruppi della categoria A si poteva ragionevolmente pensare che potessero entrare nello scopo del metodo.
Così è stato tanto che alla fine delle fasi di sviluppo/validazione è stato possibile inserire i seguenti gruppi: A1 (stilbenici), A3 (steroidi), A4 (RALs) e A5 (beta-agonisti). Inoltre, si sono aggiunte anche alcune sostanze o gruppi di sostanze del gruppo A6, ovvero i nitroimidazolici, il cloramfenicolo, la clorpromazina e il dapsone. Infatti la rilevazione simultanea ai livelli di interesse anche di questi farmaci è sicuramente un valore aggiunto. Sebbene per le loro caratteristiche essi non siano somministrati a scopi anabolizzanti, si tratta pur sempre di farmaci vietati e quindi di un problema di salute pubblica.

La loro presenza nella bile sarebbe un indizio di un trattamento terapeutico non autorizzato. Infine, si sono aggiunti anche i corticosteroidi, (sottogruppo B2f) che a rigore non appartengono al gruppo A, ma sono composti il cui uso in allevamento a scopo anabolizzante è ben documentato. E' importante sottolineare che, sulla base alle nostre conoscenze, questo è il primo metodo in grado di rilevare ai livelli di interesse una gamma tanto ampia di molecole nella bile (57 analiti). Va da sé che la disponibilità di questo screening rende fattibile e auspicabile l'utilizzo della bile come matrice complementare nei controlli ufficiali previsti dall'Unione al macello.
Riassumendo il tentativo è stato duplice: i) migliorare la rilevabilità di alcune sostanze utilizzando un fluido biologico diverso dall'urina e che ha dimostrato in studi "in vivo" di avere la capacità di bioconcentrarle; ii) migliorare le chances di identificazione degli eventuali composti illeciti somministrati determinando simultaneamente un pacchetto molto più consistente di molecole rispetto agli screening tradizionali. Ultimo, ma non ultimo, l'implementazione di questa procedura è sostanzialmente compatibile con le attuali risorse e competenze di molti dei laboratori IIZZSS, come dimostrato dalla prova inter-laboratorio.


OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 103/2017 di SPVet.it



Galarini et al., 2017 - Nuove matrici target nel controllo dei trattamenti anabolizzanti in bovini (SPVet.it 103/2017)
Galarini et al., 2017 - Nuove matrici target nel controllo dei trattamenti anabolizzanti in bovini (SPVet.it 103/2017)


Bibliografia

Beef hormone controversy. Accessed on 31/03/2017 available from Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Beef_hormone_controversy

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Direttiva 96/23/CE del Consiglio del 29 aprile 1996 concernente le misure di controllo su talune sostanze e sui loro residui negli animali vivi e nei loro prodotti e che abroga le direttive 85/358/CEE e 86/469/CEE e le decisioni 89/187/CEE e 91/664/CEE. Gazzetta ufficiale delle Comunità europee, L125 (1996) 10-32.

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Ricerca Corrente IZSUM 022012. Dai metodi multiresiduo ai multiclasse: sviluppo di protocolli innovativi nel campo della ricerca dei residui di farmaci veterinari vietati in urina.




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