Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 102, Giugno 2017 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Sorveglianza e prevalenza di ceppi di Salmonella enterica produttori di ESBL (Extended Spectrum β-Lattamase) nella Regione Marche: emergenza di un clone multi resistente di Salmonella Infantis ESBL dal 2013
Surveillance and prevalence of ESBL (Extended Spectrum β-Lattamase) producing strains of Salmonella enterica in Marche Region: emergence of a clonal lineage of multidrug-resistant ESBL-producing Salmonella Infantis from 2013
Monica Staffolani, Maira Napoleoni, Laura Medici, Stefano Fisichella
Abstract. This work show the results relative to the routine activity of CRRep (Regional Reference Center for Enterobacteria) of the Marche Region from 2005 regarding the monitoring of antibiotic resistance referred to the ESBL phenotype, and the emergence of a clonal lineage of multidrug-resistant ESBL-producing Salmonella Infantis from 2013. The average frequency of ESBL Salmonella strains belonging to different serotypes from 2005 to 2012 is 0,9% (15/1718) and we find two ESBL genes: blaSHV-12 e blaCTX-M-1. In the 4-year period from 2013 to 2016, however, the frequency has undergone a considerable increase reaching an average of 8,8% (103/1170) with the totality of the strains belonging to serotype Infantis and carriers of blaCTX-M-1 gene. Regarding the origin of the strains, the presence of ESBL S. Infantis was recorded almost entirely among avian samples (broilers farm and fresh or processed broiler meat), as well as in human samples
Riassunto. Questo lavoro mostra i risultati provenienti dall'attività routinaria del CRRep (Centro di Riferimento Regionale per gli enterobatteri patogeni) della Regione Marche riguardo il monitoraggio dell'antibiotico resistenza riferita al fenotipo ESBL in atto dal 2005, e l'emergenza di un clone di S. Infantis ESBL a partire dal 2013.
La frequenza percentuale media di ceppi di Salmonella ESBL appartenenti a vari sierotipi dal 2005 al 2012 risulta pari all'0,9% (15/1718) con la presenza di 2 geni ESBL: blaSHV-12 e blaCTX-M-1. Nel periodo di 4 anni 2013-2016, invece, la frequenza ha subito un notevole aumento arrivando ad una media del 8,8% (103/1170) con la totalità dei ceppi appartenenti al sierotipo Infantis e portatori del gene blaCTX-M-11. Riguardo l'origine degli stipiti, la presenza di S. Infantis ESBL si è registrata pressoché esclusivamente tra campioni di origine avicola (allevamenti di polli da carne e carne fresca o lavorata di pollo), nonché in campioni di origine umana
Introduzione
A livello mondiale la frequenza dei ceppi appartenenti al genere Salmonella enterica resistenti alle cefalosporine di ultima generazione isolati da casi umani è aumentato dalla fine degli anni '90 (Zhao et al., 2001).
Il fenomeno si è imposto sempre più all'attenzione della comunità scientifica tanto da indurre per la prima volta l'EFSA nel 2011 a pubblicare un articolo a proposito del rischio per la salute pubblica in merito alla diffusione del fenotipo ESBL (Scientific Opinion EFSA Journal 2011). Infatti, le cefalosporine di terza e quarta generazione rappresentano farmaci di prima scelta per la cura di infezioni batteriche gravi e la possibilità di fallimento terapeutico è elevata durante infezioni sostenute da batteri come Salmonella, Klebsiella pneumoniae o Escherichia coli che possiedono β-lattamasi a spettro esteso (ESBL). I geni più diffusi appartengono alle famiglie blaTEM, blaSHV, blaCTX-M e sono geni di origine plasmidica in grado di passare da un genere batterico all'altro.
A livello europeo nel febbraio 2015 le 3 principali agenzie che si occupano di salute pubblica, sicurezza alimentare e farmaci (ECDC, EFSA, EMA) hanno pubblicato il primo rapporto congiunto (ECDC/EFSA/EMA, 2015. EFSA Journal) che mostra come l'Italia si distingue per essere il paese europeo con il più alto consumo di antibiotici negli allevamenti di animali da reddito. In particolare il settore avicolo, in cui prevalgono tipologie di allevamento intensivo, sembra essere quello più interessato da fenomeni di resistenza antibiotica multipla.
Metodi
Ceppi batterici: gli isolati di Salmonella derivano dall'attività routinaria del CRRep, che dal 2002 riceve gli stipiti isolati nella Regione Marche sia di origine umana che non umana (veterinaria, alimentare, ambientale).
Sierotipizzazione: per la determinazione del sierotipo è stata seguita l'ultima edizione dello schema di Kauffman White (2007 ed. n°9) mediante l'utilizzo di sieri del commercio (SSI, Denmark).
Saggio di sensibilità agli antimicrobici CLSI: è stato effettuato con la tecnica della diffusione in agar secondo le linee guida CLSI (CLSI, January 2007), utilizzando dischetti antimicrobici del commercio (OXOID). Ampicillina (A) 10 mg, Cloramfenicolo (C) 30 mg, Ceftazidime (CAZ) 30 mg, Streptomicina (S) 10 mg, Sulfonamidi (Su) 300 mg, Tetraciclina (T) 30 mg, Acido nalidixico (Nal) 30 mg, Cefotaxime (CTX) 30 mg, Ciprofloxacina (Cip) 5 mg, Gentamicina (Gm) 10 mg, Kanamicina (Kan) 30 mg, Amoxicillina-Acido clavulanico (Amc) 30 mg, Trimethoprim-Sulfametossazolo (Sxt) 1.25/23.75 mg e Cefalotina (Kf) 30 mg. Per i ceppi di origine non umana è stato testato in aggiunta un altro antibiotico, la Colistina (Cl) 10 mg.
Saggio per il fenotipo ESBL: il monitoraggio dei ceppi di Salmonella potenzialmente produttori di ESBL è stato eseguito tramite il metodo del doppio disco (Shah et al., 2004). Più in dettaglio l'antibiogramma eseguito di routine con 14 o 15 dischi come sopra illustrato prevede il posizionamento del disco di Amc tra il disco di CTX e quello di CAZ. Se uno dei due aloni di inibizione presenta un diametro inferiore alla soglia di sensibilità, con o senza la caratteristica forma dell'alone che evidenzia la sinergia tra AMC e le cefalosporine di terza generazione (figura 1), il ceppo viene sottoposto a conferma per ESBL.
Figura1: Test di sensibilità agli antibiotici, dettaglio di una piastra di Muller Hinton Agar.
[notare la caratteristica forma dell’alone che evidenzia la sinergia tra AMC e le cefalosporine di terza generazione]
Figure 1. Antibiotic sensitivity test - detail of a Muller Hinton Agar plate.
[note the characteristic shape of the alone that highlights the synergy between AMC and third generation cephalosporins]
Conferma del fenotipo ESBL e caratterizzazione molecolare: gli isolati che presentavano un profilo fenotipico compatibile con ESBL sono stati inviati al Centro di Referenza Nazionale per l'Antibioticoresistenza (CRAB), presso l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana, dove gli isolati sono stati sottoposti al test di conferma fenotipico secondo standard CLSI. Il 99% dei ceppi risultati positivi al primo saggio di screening per il fenotipo ESBL eseguito nel laboratorio del CRRep, è stato confermato presso il CRAB. La caratterizzazione molecolare è avvenuta mediante saggio di PCR per i geni blaCTX-M, blaSHV, blaOXA, blaTEM, blaCMY-1, blaCMY-2. Gli ampliconi ottenuti (blaSHV e blaCTX-M) sono stati sequenziati secondo Sanger e le sequenze ottenute sono state comparate con quelle depositate nel GenBank nucleotide database.
Test di sensibilità agli antibiotici EUCAST: presso il CRAB i ceppi inviati risultati positivi per il fenotipo ESBL, sono anche stati sottoposti a test di sensibilità agli antibiotici tramite il metodo della minima concentrazione inibente (MIC) seguendo le linee guida e i parametri EUCAST (www.eucast.org).
PFGE: l'omologia genetica è stata determinata tramite elettroforesi pulsata in gel di agar in campo pulsato (PFGE) utilizzando l'enzima di restrizione XbaI (Fermentas Life Science) in accordo con il protocollo standardizzato della rete di sorveglianza PulsNet (w(www.pulsenetinternational.org/networks/europe).
Salmonella enterica sierotipo Braenderup H9812 è stata usata come marcatore di peso molecolare.
Il dendrogramma e la cluster analysis sono stati eseguiti presso l'Istituto Superiore di Sanità usando il software BioNumerics (v. 6.1, Applied Math, Sint-Martens-Latem, Belgio). I valori di similarità sono stati calcolati con il coefficiente di Dice mentre l'algoritmo UPMGA (unweighted pair group method with arithmetic means), con 1.00% di tolleranza e 1.00% di ottimizzazione, è stato impiegato per ottenere il dendrogramma.
Risultati
Presso il CRRep di Macerata dal 2005, è in atto un monitoraggio continuo per la presenza del fenotipo ESBL tra i ceppi di enterobatteri patogeni, in larga prevalenza salmonelle, sottoposti in modo sistematico ad antibiogramma.
Nel triennio 2005-2007 sono stati isolati i primi 6 stipiti di Salmonella portatori di enzimi ESBL di cui 5 appartenenti al sierotipo Livingstone, probabilmente appartenenti allo stesso clone, isolati presso uno stabilimento di produzione di carni avicole ed un ceppo di variante monofasica di S. Typhimuirium (4,(5),12:i:-) isolato da feci di pollo (ISSN 0393-5620 ISTISAN Congressi 07/C5), (tabella 1).
Riguardo il periodo 2008-2011 è stato pubblicato un articolo dal quale emergeva sostanzialmente l'aumento di frequenza nel settore veterinario e la comparsa di ceppi ESBL di Salmonella anche in campo umano, appartenenti ai sierotipi Thompson e Derby (Staffolani M. et al., 2011), (tabella 1 e 2).
Table 1. Results of the ESBL phenotype monitoring: cases of non-human origin
Table 2. Results of ESBL phenotype monitoring: cases of human origin
I dati raccolti dal 2013 al 2016, mostrano un cambiamento notevole. Infatti, il periodo compreso tra il 2005 e il 2012 è stato caratterizzato da una certa eterogeneità nei sierotipi e nella matrice dei ceppi rilevati, mentre dal 2013, tutti i ceppi di Salmonella ESBL individuati sono stati tipizzati come S. Infantis e isolati a partire da allevamenti di polli da ingrasso o da carne di pollo.
Complessivamente la frequenza percentuale media di ceppi di Salmonella ESBL appartenenti a vari sierotipi dal 2005 al 2012 risulta pari allo 0,9% (15/1718) con la presenza di 2 geni ESBL: blaSHV-12 o blaCTX-M-1. Nel periodo di 4 anni 2013-2016, invece, la frequenza raggiunge la media dell' 8,8% (103/1170) con la totalità dei ceppi appartenenti al sierotipo Infantis e portatori del gene blaCTX-M-1. Riguardo l'origine degli stipiti, la presenza di S. Infantis ESBL si è registrata pressoché esclusivamente tra campioni di origine avicola (allevamenti di polli da carne e carne fresca o lavorata di pollo), nonché in campioni di origine umana.
Si riportano qui di seguito in dettaglio i 7 casi umani (tab.2).
- 2013: primo caso di S. Infantis ESBL nelle Marche isolato dalle feci di un bambino di 2 anni che non ha richiesto ospedalizzazione
- 2014: secondo caso isolato da un bambino di 10 anni che non ha richiesto ricovero
- 2015: 2 casi di S. Infantis ESBL di cui uno recidivante con doppio isolamento da feci e urine isolato da una donna di 71 anni ospedalizzata, mentre l'altro caso è relativo all'isolamento dalle feci di un bambino di 2 anni non ricoverato
- 2016: 3 ceppi isolati dalle feci di un anziano di 96 anni, di un bambino di 1 anno e di un bambino di 2 anni non ospedalizzati
Riguardo il profilo di resistenza antibiotica, gran parte delle molecole nei confronti di cui è stata rilevata resistenza seguendo le linee CLSI, sono coincidenti con quelle rilevate con il metodo MIC seguendo le linee guida EUCAST. Si tratta di un nucleo centrale di 7 molecole (CTX, A, T, Sxt, T, Nal, Cip) in cui è evidente la presenza contemporanea della resistenza al Cefotaxime ed alla Ciprofloxacina, i due principali antibiotici usati in medicina umana.
L'analisi dei profili genotipici ottenuti in PFGE ha permesso di stabilire che tutti i ceppi di S. Infantis ESBL isolati presso il CRRep, di origine umana e non, appartengono allo stesso pulsotipo XbaI0126. Anche a livello nazionale il pulsotipo prevalente risulta essere lo stesso, tuttavia per quanto circolaino anche altri pulsotipi (XbaI0125, XbaI0126, XbaI0129, XbaI2116) che presentano un'omologia piuttosto elevata tra di loro (>90%).
I dati registrati nella Regione Marche appaiono in linea con il trend nazionale.
Infatti, in tutta la penisola, come anche in alcune regioni europee, dal 2011 si è assistito all'aumento della diffusione di S. Infantis ESBL. Presso il CRAB si è potuto dimostrare l'esistenza di una linea clonale emergente di S. Infantis multi resistente trasmessa dai polli e dalla carne di pollo all'uomo (Franco A., et al., 2015).
Recentemente è stato pubblicato un articolo dall'Istituto Superiore di Sanità di Roma riguardo la diffusione nell'uomo in Italia di S. Infantis ESBL nel periodo 2013-2015 (Dionisi A.M., et al., 2016) dove si ricorda che questo clone multi resistente è particolarmente diffuso in Italia rispetto all'Europa e rappresenta un rischio per la salute pubblica a causa del limitato pannello di antibiotici che è possibile usare nella terapia.
Conclusioni
Il fenomeno dell'antibiotico resistenza in Salmonella legato alla presenza degli enzimi ESBL, sta diventando un problema sempre più serio.
Al momento attuale il fenomeno risulta più diffuso nei paesi dell'Asia (Jabeen et al., 2010) e dell'Africa (Beyene et al., 2011; Naas et al., 2011), mentre in Europa la segnalazione di salmonelle con fenotipo ESBL risulta meno frequente (Meakins et al., 2008; Pardos de la Gándara et al., 2011).
Tuttavia le agenzie europee della salute hanno lanciato di recente un'allerta dovuta all'aumento considerevole del fenomeno al quale ha in gran parte contribuito l'emergenza del clone di S. Infantis ESBL (Scientific Opinion EFSA Journal 2011; 9(8):2322; ECDC/EFSA/EMA, 2015. EFSA Journal).
Sulla base dei dati presentati nello studio è chiaramente ipotizzabile un legame tra i sierotipi isolati nell'uomo e quelli isolati nei ceppi di origine animale, con un possibile coinvolgimento del pollame come serbatoio di questi batteri.
Considerando che spesso le salmonelle con fenotipo ESBL risultano più virulente e che frequentemente coinvolgono comunità ospedaliere, riteniamo sia importante effettuare una sorveglianza della circolazione delle salmonelle resistenti alle cefalosporine di terza e quarta generazione sia negli animali che nell'ambiente.
Si auspica, inoltre, una maggiore attenzione nell'uso degli antibiotici critici sia in campo veterinario che in campo umano, nonché investimenti nel settore avicolo nella ricerca di metodi alternativi all'uso degli antibiotici (batteriofagi e relative lisine; peptidi antibatterici di origine animale o vegetale; estratti di erbe e oli essenziali, probiotici e prebiotici).
Bibliografia
Beyene G., Nair S., Asrat D., Mengistu Y., Engers H., Wain J. (2011). Multidrug resistant Salmonella Concord is a major cause of salmonellosis in children in Ethiopia. J Infect Dev CtrieS. 1;5(1):23-33.
CLSI. January 2007, M100-S17. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, seventeenth informational supplement.
Dionisi A. M.,Owczarek S., Benedetti I., Luzzi I. (2016) Extended-spectrum ?-lactamase-producing Salmonella enterica serovar Infantis from humans in Italy. International Journal of Antimicrobial Agents (48) p. 345-346
ECDC/EFSA/EMA first joint report on the integrated analysis of the consumption of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from humans and food-producing animalS. Stockholm/Parma/London: ECDC/EFSA/EMA, 2015. EFSA Journal 2015;13(1):4006, 114 pp. doi:10.2903/j.efsa.2015.4006
Franco A., Leekitcharoenphon P., Feltrin F., Alba P., Cordaro G., Iurescia M., Tolli R., D'Incau M., Staffolani M., Di Giannatale E., Hendriksen RS., Battisti A. (2015) Emergence of a clonal lineage of multidrug-resistant ESBL-producing Salmonella Infantis transmitted from broilers and broiler meat to humans in Italy between 2011 and 2014. PLoS One , Dec 30;10(12) pag 1-15.
ISSN 0393-5620 ISTISAN Congressi 07/C5- Atti 3° Workshop di epidemiologia veterinaria - pag.104.
Jabeen K., Zafar A., Irfan S., Khan E., Mehraj V., Hasan R. (2010). Increase in isolation of extended spectrum beta lactamase producing multidrug resistant non typhoidal Salmonellae in Pakistan.BMC Inf Dis, (10): 101.
Meakins S., Fisher I. S., Berghold C., Gerner-Smidt P., Tschäpe H., Cormican M., Luzzi I., Schneider F., Wannett W., Coia J., Echeita A., Threlfall E. J. (2008). Antimicrobial drug resistance in human nontyphoidal Salmonella isolates in Europe 2000-2004: a report from the Enter-net International Surveillance Network. Microb Drug Resist. 14(1):31-5.
Naas T., Bentchouala C., Cuzon G., Yaou S., Lezzar A., Smati F., Nordmann P. (2011). Outbreak of Salmonella enterica serotype Infantis producing ArmA 16S RNA methylase and CTX-M-15 extended-spectrum ?-lactamase in a neonatology ward in Constantine, Algeria. Int J Antimicrob Agents ;38(2):135-9. Epub 2011 Jun 11.
Pardos de la Gándara M., Seral C., Castillo García J., Rubio Calvo C., Weill F X. (2011). Prevalence and characterization of extended-spectrum beta-lactamases-producing Salmonella enterica isolates in Saragossa, Spain (2001-2008). Microb Drug Resist. ;17(2):207-13. Epub 2011 Jan 16.
Shah A. A., Hasan F., Ahmed S., Hameed A. (2004). Extended-spectrum beta-lactamases (ESbLs): characterization, epidemiology and detection. Crit Rev Microbiol.; 30(1):25-32.
Scientific Opinion EFSA Journal 2011; 9(8):2322
Staffolani M., Medici L., Campanari S., Franco A., Di Matteo P., Fisichella S. (2011). Monitoring and molecular characterization of ESBL producing strains of Salmonella enterica in Marche Region (2008-2011). Sanità Pubblica Veterinaria-SPVet.it N°69, 2011
Zhao S., White D. G., McDermott P. F., Friedman S., English L., Ayers S., Meng J., Maurer J. J., Holland R., Walker R. D. (2001). Identification and expression of cephamycinase bla(CMY) genes in Escherichia coli and Salmonella isolates from food animals and ground meat. Antimicrob Agents and Chemother. dec.2001: 3647-3650
Staffolani et al., 2017 - Sorveglianza e prevalenza di ceppi di Salmonella enterica produttori di ESBL (Extended Spectrum β-Lattamase) nella Regione Marche: emergenza di un clone multi resistente di Salmonella Infantis ESBL dal 2013 (SPVet.it 102/2017)
