Semina effettuata per diluizione:
La parte interna del frammento di polmone prelevato va strisciata sulla superficie della piastra di SDA dividendola idealmente in quattro quadranti ed eseguendo la strisciata solo su un quadrante.



Passaggio delle colonie:
A partire da ogni singola colonia sospetta vanno allestite delle subcolture su SDA con la tecnica della semina per diluizione.

Nel caso in cui l'esito dell'identificazione macro e microscopica non dia un risultato soddisfacente si può decidere di procedere ad una diagnosi molecolare, attraverso le seguenti fasi:

• estrazione del DNA;
• amplificazione del DNA PCR end- point con i Primer
  • ITS4 (5'-TCC TCC GCT TTA TTG ATA TGC -3')
  • ITS5 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G -3')
• elettroforesi in gel di Agarosio;
• sequenziamento genico.

Per ogni campione di polmone è stata contrassegnata una piastra di CAFC (Caffeic Acid Ferric Citrate) medium con il n° di accettazione e la data. Dopo aver sterilizzato la superficie dell'organo con una spatola riscaldata alla fiamma di un becco Bunsen, viene isolato un frammento dell'organo con pinze e forbici sterili.

Nel caso in cui la colonia risulti Gram + e di morfologia riconducibile a lievito, prolungare l'incubazione fino a 5 + 2gg, in modo che nel caso sia C. neoformans avrà aspetto liscio, convesso, traslucente, gelatinoso o mucoso e pigmentazione di colore bruno-nero, grazie all'attività fenolo-ossidasica del lievito; in caso di lievito diverso da C. neoformans, si avrà lo stesso aspetto macroscopico ma con colore variabile dal crema al beige.

Preparazione del campione:
Una quantità di circa 1 gr di feci (prelevato a livello di intestino tenue e dei ciechi) viene sminuzzata in un mortaio mescolando gradatamente con 15 ml di soluzione di flottazione (cloruro di sodio densità = 1.200) sino ad ottenere una sospensione il più omogenea possibile. Filtrare circa 10 ml di sospensione attraverso uno strato di garza posto in un imbuto infilato in una provetta di polipropilene identificata con il numero di accettazione, al fine di trattenere il materiale più grossolano. Si aggiunge la soluzione di flottazione mediante pipetta pasteur monouso fino a formare un menisco all'apice della provetta. Sul menisco si appoggia delicatamente un vetrino copri-oggetto poco più grande del diametro della provetta che si lascia in situ per 20 minuti. Trascorsi i venti minuti, il copri-oggetto viene trasferito su un vetrino portaoggetti per l'osservazione avendo cura, durante il sollevamento ed il trasferimento, di mantenerlo perfettamente orizzontale.

Identificare le uova e/o oocisti osservate seguendo lo schema interpretativo consigliato dal testo "Parassitologia e Malattie Parassitarie degli animali" citato in bibliografia e qui brevemente riassunto: Strongili gastrointestinali: uova di forma ellittica, parete sottile, interno trasparente, morula centrale scura, numero variabile di blastomeri (numerosi in alcuni trichostrongilidi), diametro maggiore ± 75/80 µm.



Coccidi: oocisti di forma rotonda o ellissoidale, con parete liscia sottile ed incolore, sporulate o asporulate.

Trichomonas spp: protozoo flagellato piriforme di circa 12-20 µm x 8-12 µm con tre-cinque flagelli e membrana ondulata.

Histomonas spp: protozoo flagellato pleomorfico ameboide di diametro variabile fra i 6-20 µm

Capillaria spp: uova a forma di barile, chiare, misurano 48-53 µm x 24 µm, hanno la parete spessa, lievemente striata e sono munite di tappi ai due poli.

Syngamus spp: uova ellissoidali a parete sottile, misurano 70-100 µm x 43-46 µm ed hanno uno spesso opercolo ad entrambe le estremità.

Ascaridia spp/ Heterakis spp: uova ovali con un guscio liscio e non facilmente distinguibile da quello di un altro comune nematode del pollame, Heterakis.

Raillietina tetragona: le uova presenti nelle capsule ovigere all'interno delle proglottidi misurano 65 µm x 90 µm

È stata eseguita a partire da omogenati mediante un kit commerciale che si basa sulla capacità del DNA e degli acidi nucleici in generale di adsorbirsi a particelle di silice in presenza di sali caotropici come Guanidina Idrocloruro (GuHCl) o Guanidina Isotiocianato (Gu SCN).
Gli ioni dei sali caotropici, carichi positivamente, creano un ponte cationico tra il DNA e la membrana di silice presente nella colonna, entrambi carichi negativamente.

Poiché in seguito alla lisi, gli acidi nucleici diventano facilmente aggredibili da parte delle proteasi cellulari (nucleasi), è necessario aggiungere un enzima (Proteinasi K) in grado di degradare le stesse e salvaguardare l'integrità degli acidi nucleici. L'aggiunta del tampone di eluizione a basso contenuto salino, permette il successivo distacco del DNA dalla Silice e la sua liberazione in soluzione.

I componenti essenziali della PCR sono:

1. 1. due inneschi oligonucleotidici di sintesi (primer) complementari a regioni dei filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza di DNA bersaglio e che, dopo l'ibridazione con il DNA stampo abbiano le proprie estremità ossidriliche 3' orientate l'una verso l'altra;
2. 2. una sequenza bersaglio nel campione di DNA che si collochi tra l'uno e l'altro innesco;
3. 3. una DNA polimerasi termostabile capace di resistere a più di 95°C;
4. 4. i quattro desossiribonucleotidi (Adenina, Guanina, Citosina, Timina);
5. 5. MgCl2

Questi componenti miscelati in un opportuno buffer costituiscono la cosiddetta "mix" di reazione.
L'amplificazione consta di tre fasi fondamentali:

• denaturazione del DNA a 95°C in modo da provocare l'apertura dei due filamenti di acido nucleico;
• rinaturazione (50∼70°C) durante la quale avviene l'annealing (appaiamento) dei primer;
• allungamento: innesco della polimerasi con sintesi dei nuovi filamenti sullo stampo dei precedenti (∼ 72°C)

La reiterazione ciclica di queste fasi permette di accrescere esponenzialmente la quantità di partenza del DNA stampo. La polimerasi in questione (Taq) è ottenuta dal batterio Thermus acquaticus, un microrganismo termofilo, ed è grazie alla sua caratteristica di termostabilità a temperature superiori a 95°C che è stata semplificata la reazione di amplificazione, altrimenti vincolata da macchinosi processi di ripristino dell'enzima.
I cicli di PCR possono essere semplificati utilizzando uno strumento automatico detto amplificatore o termociclatore. Tale strumento, una volta messa la "mix" nelle provette, con il relativo DNA, esegue l'intero processo di amplificazione senza ulteriore lavoro da parte dell'operatore.
Il DNA amplificato viene poi fatto correre in un gel di agarosio per la verifica dell'amplificazione.

Tale metodo di separazione è basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche sotto l'influenza di un campo elettrico.
Il principio base è quello di un setaccio molecolare attraverso il quale le diverse molecole vengono fatte passare: la velocità di migrazione dipende dalla massa, dalla dimensione, dalla carica e dalla forma delle varie particelle, ossia dalla loro mobilità elettroforetica. Questa grandezza è il rapporto tra la velocità della particella (cm/s) e il campo elettrico utilizzato (Volt/cm).

La mobilità elettroforetica, essendo una funzione del rapporto tra carica e raggio, è diversa da una particella ad un'altra; applicando un campo elettrico ad una miscela ionica le varie specie migreranno con velocità diversa a seconda delle rispettiva mobilità. Frammenti di lunghezza minore sono meno ostacolati nella loro corsa attraverso le maglie del gel per cui si muovono a velocità maggiore rispetto a frammenti più lunghi. Alla fine di una corsa elettroforetica, quindi, frammenti più piccoli si troveranno nella parte bassa del gel mentre i frammenti più grossi saranno localizzati nella parte prossima al punto di caricamento

In condizioni standard la mobilità elettroforetica di molecole di DNA è proporzionale al logaritmo della loro massa. Per calcolare il peso molecolare dei frammenti viene effettuata una calibrazione con molecole di DNA di peso noto, detto marker. Il DNA viene colorato con un "intercalante safe" (midori green-Nippon genetics Europe GmbH®), una molecola fluorescente alla luce ultravioletta, che si intercala nella doppia elica dell'acido nucleico.
La migrazione elettroforetica che avviene su un supporto solido di natura porosa imbevuto di una soluzione elettrolitica (tampone che permette il passaggio della corrente) prende il nome di elettroforesi zonale in quanto le sostanze restano separate in zone ben distinte.

I primi cinque cicli della reazione infatti, prevedono la diminuzione della temperatura di appaiamento (annealing) di un grado a ciclo. La strategia di reazione touch-down permette di rendere i primi cicli di PCR estremamente "stringenti", tali cioè da promuovere l'amplificazione solo di frammenti specifici rendendo instabili eventuali annealing dei primer a sequenze di DNA non perfettamente complementari.

In effetti una temperatura troppo bassa porta all'annealing dei primer a sequenze non esattamente complementari e quindi all'amplificazione di frammenti non specifici, mentre una temperatura troppo alta può ridurre la resa in quanto solo una frazione delle molecole del primer riesce ad innescare la polimerizzazione a causa dell'elevata instabilità del loro appaiamento con il DNA stampo. Per ciascuna sessione di lavoro in cui vengono posti ad amplificare campioni in esame, vanno aggiunti un campione negativo di amplificazione (acqua bidistillata) e un campione positivo di amplificazione (DNA già estratto da un campione positivo già noto).

PCR -RFLP (Restriction Fragment of Lenght Polymorphism) per Chlamydia spp.
La procedura in uso presso il laboratorio di Diagnostica dell'IZSUM (Ossewaarde e Meijer 1999; Vicari et al., 2004) per l'identificazione della Chlamydia si basa sull'amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi di una specifica sequenza bersaglio sul gene 16 S rRNA di Chlamydophila/Chlamydia; tale target essendo comune a diverse specie (psittaci, abortus, pecorum, trachomatis, felis, pneumoniae, suis) si presta ad una successiva analisi di restrizione enzimatica mediande endonucleasi di restrizione Tru 1 I o INF I, le quali producono enzimi di restrizione specifici che determinano il taglio del DNA o di una sua porzione a livello di sequenze enzima - specifiche originando una serie di frammenti di dimensione nota. L'analisi di tali frammenti consente la successiva tipizzazione delle specie Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila felis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila trachomatis, Chlamydophila suis.

a) Estrazione del campione
Tale procedura si applica su DNA genomico estratto da pool di feci come precedentemente descritto. La procedura in uso presso il laboratorio di Diagnostica dell'IZSUM è una PCR touch-down.

b) Amplificazione del DNA
I primi cinque cicli della reazione infatti prevedono la diminuzione di un grado a ciclo della temperatura di appaiamento (annealing). Per ciascuna sessione di lavoro in cui vengono posti ad amplificare campioni in esame, vanno aggiunti un campione negativo di amplificazione (acqua bidistillata) e un campione positivo di amplificazione (DNA già estratto di un campione positivo già noto). I primer utilizzati hanno le seguenti sequenze:
Primer CHLA 16S Forward : 5'-CGTGGATGAGGCATGCAAGTCGA-3'
Primer CHLA 16 S Reverse: 5'-ATCTCTCAATCCGCCTAGACGTC-3'
La mix della reazione è stata allestita utilizzando la GoTaq® DNA polimerasi e utilizzando le concentrazioni come di seguito indicato:
Figura 20. Mix di reazione e profilo termico di amplificazione



c) Interpretazione dei risultati
Gli amplificati vanno caricati su gel di agarosio al 2% e letti agli UV. Sarà considerato positivo il campione che avrà un amplificato di peso molecolare pari a 270 bp.
I campioni venuti positivi all'amplificazione con i primers specifici per Chlamydophila/Chlamydia possono essere sottoposti a digestione enzimatica con TRu1 I per l'identificazione di alcune specie. La reazione di digestione è da considerarsi correttamente eseguita quando i controllo positivi presentano un profilo di restrizione corrispondente a quello atteso come di seguito descritto:



Per distinguere la Chlamydophila psittaci dalla felis e dalla pneumoniae si può usare l'enzima Hinf I. la reazione di digestione è da considerarsi correttamente eseguita quando i controlli positivi presentano un profilo di restrizione corrispondente a quello atteso:



PCR per Toxoplasma gondii
L'esame, eseguito seguendo la letteratura (Magnino et al., 2000) procedura standard in uso presso il laboratorio di Diagnostica dell'IZSUM si esegue su un omogenato di organi (polmone e cervello).





a) Estrazione del campione
Preparare una serie di provetta da 2 ml opportunamente identificate.
Porre in ciascuna provetta una biglia metallica e 1.2 ml di soluzione fisiologica.
Prelevare una porzione pari a 0.5 grammi dal polmone e dal cervello e porla nella provetta. Trasferire e provette negli alloggiamenti del Tissue lyser avendo cura di bilanciare i due alloggiamenti tra di loro.
Per omogeneizzare porzioni d'organo di queste dimensioni lo strumento va utilizzato ad una frequenza pari a 20 Hz per 10 minuti.

In ogni seduta di estrazione va estratto un campione negativo e uno positivo. Per avere un controllo negativo di estrazione aggiungeremo 200 µl di Acqua bidistillata al posto della sospensione di organo; tale controllo ci permette di escludere contaminazioni in fase di estrazione. Come controllo positivo di estrazione invece verrà utilizzata una sospensione di organo già venuta positiva; tale controllo ci permette di garantire l'efficacia e l'efficienza dei reagenti e degli apparecchi utilizzati.

Per l'estrazione si utilizza il protocollo per fluidi biologici allegato al QIAmp DNA Mini Kit-QIAGEN:

• Porre 200 µl di Buffer AL in provette da 1.5 ml correttamente identificate.
• Prelevare 200 µl di sospensione dell'omogenato d'organo ed aggiungerlo alla provetta con il Buffer AL.
• Aggiungere ad ogni provetta 20 µl di proteinasi K.
• Vortexare le provette e incubare in un termomixer a 58°C per 10 minuti agitando a 1200 rpm.
• Spinnare velocemente le provette per rimuovere eventuali gocciolina dal tappo.
• Aggiungere 200 µl di Etanolo per arrestare l'azione della proteinasi K.
• Trasferire tutto il materiale dalle provette alle colonnine opportunamente identificate.
• Centrifugare le colonnine per 1 min. a 8000 rpm.
• Traferire le colonnine in nuovi tubi e aggiungere 500 µl di Buffer AW1 facendo attenzione a non toccare la colonnina con il puntale.
• Chiudere le colonnine e centrifugare per 1 min. a 8000 rpm.
• Al termine della centrifugata trasferire le colonnine su nuovi tubi.
• Aggiungere in ogni colonnina 500 µl di Buffer AW2 con le stesse modalità descritte prima.
• Centrifugare per 3 min. a 13500 rpm .
• Porre le colonnine su delle provette da 1.5 ml identificate ed eluire il DNA dalla colonnina aggiungendo 200 µl di Buffer AE. Lasciare il buffer a contatto per almeno 1 minuto. Centrifugare per 1 min. a 8000 rpm.
• Richiudere le provette contenenti il DNA che se non viene utilizzato subito va conservato a -20°C.

b) Amplificazione del DNA
La procedura in uso presso il laboratorio di Diagnostica dell'IZSUM è una PCR touch down. Si basa sull'amplificazione mediante PCR di una regione del gene codificante per il 18 S rRNA presente in Toxoplasma gondii.
Per ciascuna sessione di lavoro in cui vengono posti ad amplificare campioni in esame, vanno aggiunti un campione negativo di amplificazione (acqua bidistillata) e un campione positivo di amplificazione (DNA già estratto di un campione positivo già noto).

I primer utilizzati hanno le seguenti sequenze:
Primer COC 1: 5'-AAGTATAAGCTTTTATACGGC-3'
Primer COC 2: 5'-CACTGCCACGGTAGTCCAATAC-3'l

La mix della reazione è stata allestita utilizzando la GoTaq® DNA polimerasi e utilizzando le concentrazioni come di seguito indicato:



c) Interpretazione dei risultati
Gli amplificati vanno caricati su gel di agarosio al 2% e letti agli UV. Sarà considerato positivo il campione che avrà un amplificato di peso molecolare pari a 294 bp.

PCR per Criptosporidium spp. e Giardia duodenalis
Per la determinazione vengono seguite le indicazioni di letteratura (Gòmez-Couso et al., 2004).

a) Estrazione del campione
Viene impiegato un sistema di estrazione automatico, Nuclisens®, EasyMag Biomérieux, basato sulla tecnologia di estrazione con la silice (detta anche tecnologia di BOOM).
Durante l'incubazione dei campioni lisati con Lysis Buffer, contenente tiocianato di guanidina, l'acido nucleico veniva catturato da particelle di silice magnetica. Il dispositivo magnetico del Nuclisens® EasyMag attrae la silice, dando la possibilità al sistema di purificare gli acidi nucleici attraverso una fase di lavaggi ripetuti eseguiti mediante l'impiego di due tamponi differenti (NucliSENS® easyMAG®; http://www.biomerieux.ch/)

Al termine del ciclo di lavaggio segue una fase di riscaldamento atta a liberare gli acidi nucleici dalla silice ed una fase finale in cui le particelle di silice magnetica vengono separate dall'eluato attraverso il dispositivo magnetico.

b) Amplificazione del DNA
Criptosporidium spp. e Giardia duodenalis sono stati ricercati mediante l'utilizzo della multiplex-nested-PCR che ha come bersaglio il gene cowp (proteina di parete dell'oociste di Cryptosporidium) ed il gene tpi (trioso fosfato isomerasi) di Giardia duodenalis assemblage A e B.
La Multiplex-Nested-PCR utilizzata permette la ricerca simultanea di Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis assemblage A e B (Gómez-Couso et al., 2004). Nella prima PCR vengono amplificate una sequenza specifica di 430 bp del gene COWP e due sequenze specifiche del gene tpi di Giardia assemblage A e B di 576 bp e 210 bp, rispettivamente con i primers PCWOPF/PCOWPR, TPIAF/TPIAR e TPIBF/TPIBR (Tabella 4).
La reazione di PCR è stata effettuata in 10 l di volume di reazione, utilizzando 5 l di estratto di DNA in tampone per PCR 1 x, 2 mM di MgCl2, 250 M di ogni dNTP, 0,3 M di ogni primer e 0,05 U/ l di Taq DNA Polimerasi. Le condizioni di amplificazione erano le seguenti: denaturazione iniziale a 94°C per 1 minuto, 25 cicli 94 C per 20 secondi, 52°C per 30 sec e 72 C per 1 minuto, seguiti da una estensione finale a 72 C per 5 minuti. Il prodotto della prima PCR è stato poi amplificato in tre reazioni separate di nested-PCR, di cui una di 341 bp specifica del gene COWP di Cryptosporidium, una di 452 bp specifica del gene tpi di G. duodenalis assemblage A e l'ultima di 141 bp specifica del gene tpi di G. duodenalis assemblage B (primers PCOWPIF/PCOWPIR, TPIAIF/TPIAIR e TPIBIF/TPIBIR, Tabella 2).

Le 3 reazioni di PCR sono state preparate in un volume finale di 20 l contenente 10 l di prodotto di PCR diluito (1/10 in acqua distillata sterile) e le seguenti concentrazioni:
tampone per PCR 1 x, 1,5 mM di MgCl2, 250 M di ogni dNTP, 1 M di ogni primer (PCOWPIF/PCOWPIR per gene COWP, TPIAIF/TPIAIR per Tpi assemblage A, TPIBIF/TPIBIR per Tpi assemblage B) e 0,1 U/ l di Taq DNA Polimerasi.
Le condizioni di amplificazione erano le seguenti per tutte e tre le reazioni: denaturazione iniziale a 94°C per 1 minuto, 25 cicli 94 C per 20 secondi, 52°C per 30 sec e 72 C per 1 minuto, seguiti da una estensione finale a 72 C per 5 minuti.
La Taq DNA polimerasi utilizzata per la PCR era la Go Taq Flexi DNA Polymerase con relativo tampone di reazione e MgCl2 (Promega). L'amplificazione in PCR è stata effettuata con un apparecchio termociclatore Mastercycler (Eppendorf).

Interpretazione dei risultati
Controlli positivi e negativi di reazione (DNA estratto da campione fecale positivo per Cryptosporidium spp. o da oocisti purificate di Cryptosporidium spp., DNA estratto da trofozoiti purificati per Giardia duodenalis assemblage A o B, acqua per PCR) sono stati inclusi per ogni analisi di PCR effettuata.
La tabella con i primer è la seguente: