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Numero 14 - maggio 2002
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Valutazione rapida della capacità antiossidante
totale in Mytilus galloprovincialis


S. Bacchiocchi **,S. Gorbi*, R. Orletti **, P. Palombo **, F. Regoli *


**Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche;
*  Istituto di Biologia e Genetica. Universitá di Ancona. Via Ranieri. Monte D'Ago 60100.
ABSTRACT

INTRODUZIONE
E' ben noto che i mitili, data la loro abitudine di tipo filtratorio, possono accumulare nei tessuti numerose classi di contaminanti chimici presenti nell' ambiente. D'altra parte questi organismi rappresentano una risorsa commerciale ed economica di straordinaria importanza e come tali vanno salvaguardati allo scopo di tutelare sia le attivitá di pesca e molluschicoltura sia la salute pubblica.
In tal senso qualsiasi strumento in grado di fornire una precoce e realistica valutazione dello stato di salute di popolazioni di mitili, siano esse di allevamento o selvatiche, si rivela di grande utilitá.

Il nostro approccio quello di valutare l'insorgenza di effetti biologici causati da contaminanti chimici mediante l'analisi di alterazioni a livello del sistema antiossidante e del comparto lisosomiale, due sistemi, la cui efficienza di fondamentale importanza nello stato di salute di un organismo, e che svolgono inoltre un ruolo chiave sia nei processi di detossificazione, che nell' insorgenza di effetti tossici dovuti alla presenza di sostanze chimiche riversate nell'ambiente.

Per quanto riguarda infatti il sistema antiossidante, una classica via di tossicitá dei contaminanti quella di aumentare la generazione intracellulare dei radicali liberi, specie altamente reattive in grado di causare effetti tossici quali perossidazione lipidica, degradazione di proteine, inattivazione di enzimi e danni a livello del DNA.

Queste molecole sono prodotte come conseguenza inevitabile del metabolismo ossidativo degli organismi aerobi, ma solo l' alterazione del normale equilibrio con le difese antiossidanti determina l'insorgenza di una condizione di stress ossidativo.
Sebbene normalmente la comparsa dello stress ossidativo si misuri mediante l'analisi dei singoli antiossidanti, in questo lavoro presentiamo una metodologia analitica che permette la valutazione della capacitá antiossidante totale di un organismo intesa come sua capacitá di resistere alla tossicitá di diverse forme di radicali liberi.
Parallelamente a queste indagini, l'attenzione stata rivolta anche al comparto lisosomiale estremamente sviluppato nei mitili (Moore, 1988) dove svolge funzioni sia legate alla digestione di sostanze nutritizie sia di tipo immunitario. Anche i lisosomi sono noti essere molto sensibili agli effetti di contaminanti di vario tipo con alterazioni che possono includere la funzionalitá delle membrane ed i normali processi di fusione che caratterizzano questo comparto vacuolare.
L'insorgenza di compromissioni a carico del sistema lisosomiale stata da noi valutata a livello degli emociti circolanti, analizzando il tempo di ritenzione di un colorante vitale, come indice di integritá della membrana (Lowe et al., 1995).
Nel presente lavoro la capacitá antiossidante totale e l'integritá lisosomiale sono state valutate in due popolazioni naturali campionate lungo la costa toscana e rispettivamente da un sito di controllo, Forte dei Marmi, e da un sito a forte inquinamento di origine industriale, Scarlino; inoltre tali analisi sono state condotte anche su organismi traslocati dal sito di controllo a quello inquinato.

MATERIALI E METODI
I mitili, M. galloprovincialis, sono stati prelevati nell' Aprile 1998 da due siti del Nord Tirreno: Forte dei Marmi come sito di controllo e Scarlino, un'area caratterizzata da alti livelli di metalli pesanti di origine industriale. Organismi prelevati da Forte dei Marmi sono stati inoltre traslocati a Scarlino e mantenuti qui per un periodo di 1 e 8 settimane.
Tutti i mitili avevano lunghezza compresa tra i 4 e i 5 cm che garantisce il confronto tra organismi in simili condizioni metaboliche.

MISURA DELLA CAPACITA' ANTIOSSIDANTE TOTALE (TOSCA)
Per ogni punto di prelievo sono stati dissezionati 25 individui e le ghiandole digestive suddivise in 5 replicati, congelate rapidamente in azoto liquido e mantenute a -80°C. I campioni sono stati poi omogenizzati in rapporto 1:4 (P/V) con tampone potassio fosfato 100 mM, pH 7,5 contenente 2,5 % NaCl, aprotinina (1 microgrammo/ml), leupeptina (1 microgrammo/ml) e pepstatina (0.5 microgrammi/ml). Dopo centrifugazione a 110.000 x g per 1 ora, il sovranatante stato aliquotato e conservato a -80°C.

La capacitá antiossidante totale stata misurata tramite il metodo TOSCA che si basa sulla ossidazione di un substrato, l'acido a-cheto-g-metiolbutirrico (KMBA), da parte di radicali liberi generati artificialmente con produzione di etilene.
In presenza di antiossidanti cellulari, questi reagiscono piú efficacemente del KMBA con i radicali, e la produzione di etilene risulta quantitativamente inibita.

Tre sistemi diversi sono stati utilizzati per generare varie forme di radicali liberi: i radicali perossilici dalla omolisi termica del 2-2'-azo-bis-(2-metil propionamidina)-diidrocloride (ABAP); i radicali idrossilici da una reazione di Fenton modificata; la perossinitrite a partire dal substrato 3-morfolinosidnonimina-HCl (SIN-1), una molecola che rilascia ossido nitrico e anione superossido che si combinano rapidamente per formare HOONO.
Le condizioni di saggio sono state : (a) 0.2 mM KMBA, 20 mM ABAP in tampone potassio fosfato 100 mM, pH 7.4 per la produzione di radicali perossilici; (b) 1.8 microM Fe3+, 3.6 microM EDTA, 0.2 mM KMBA, 180 microM acido ascorbico in tampone potassio fosfato 100 mM, pH 7.4 per la produzione di radicali idrossilici; e (c) 0.2 mM KMBA e 80 microM SIN-1 in tampone potassio fosfato 100 mM pH 7.4 contenente 0.1 mM acido dietilen triamino pentacetico (DTPA) per la produzione di perossinitrite.
La reazione stata condotta a 35°C in vials da 10ml chiuse con valvole Mininert (Supelco, Bellafonte, PA) in un volume finale di 1 ml.

Aliquote di 200 microlitri sono state prelevate dallo spazio di testa a intervalli di 10-12 min nel corso della reazione e la produzione di etilene stata misurata tramite gas cromatografo Hewlett Packard (HP 4890) equipaggiato con una colonna capillare Supelco (SPB-1) e un detector di ionizzazione a fiamma (FID).
I valori di TOSCA sono stati quantificati dall'inibizione della reazione di controllo calcolata dopo integrazione matematica dell'area descritta al di sotto delle curve cinetiche di produzione di etilene in funzione del tempo ottenute rispettivamente per controllo e campioni.

SAGGIO DEL ROSSO NEUTRO
L' emolinfa (0,5 ml) stata prelevata dal muscolo adduttore anteriore mediante siringa ipodermica contenente un egual volume di soluzione fisiologica.
Un' aliquota di 50 microlitri della sospensione stata poi dispersa su un vetrino e le cellule lasciate aderire per 15 min a 4 °C in camera buia e umida.
I monostrati di emociti sono stati incubati con 40 microlitri di una soluzione contenente circa 2 microgrammi di rosso neutro. Gli emociti sono stati esaminati al microscopio (500 ingrandimenti) ad intervalli di 15 min per determinare il tempo al quale il 50% di essi avevano rilasciato nel citosol il colorante precedentemente accumulato nei lisosomi.

RISULTATI
La Figura 1 mostra i valori di TOSC nei confronti delle diverse forme di radicali liberi misurati nei mitili delle due popolazioni naturali e negli organismi traslocati dall' ambiente di controllo a quello inquinato.

figura 1



I radicali perossilici sono risultati quelli nei confronti dei quali i mitili mostrano il maggior potere antiossidante mentre i piú bassi valori di TOSC, misurati verso i radicali idrossilici, indicano questa specie come la piú difficile da neutralizzare.
Nel confronto tra le due popolazioni naturali, i mitili hanno evidenziato differenze significative nella capacitá di neutralizzare le varie forme di radicali liberi con gli organismi provenienti dall'ambiente inquinato piú suscettibili ad una condizione di stress ossidativo.
Una inibizione del potere antiossidante stata misurata anche nei mitili traslocati che, dopo 8 settimane nell'ambiente inquinato, hanno mostrato valori TOSC significativamente piú bassi ma simili a quelli della popolazione naturale di Scarlino.

La riduzione dell'efficienza del sistema antiossidante stata accompagnata anche da una generale destabilizzazione del sistema lisosomiale misurata come tempo di ritenzione del rosso neutro negli emociti circolanti.
Mentre negli organismi di controllo il colorante rimasto compartimentalizzato all'interno dei lisosomi per tutta la durata del saggio (120 min), un tempo di ritenzione non superiore ai 60 min stato invece calcolato sia per gli organismi di Scarlino che per quelli traslocati.
Una significativa correlazione tra ridotta efficienza di neutralizzare le varie forme di radicali liberi e destabilizzazione del sistema lisosomiale stata confermata dall'analisi statistica come evidenziato nella Figura 2.

figura 2


DISCUSSIONE
I mitili, in quanto organismi filtratori, accumulano una gran varietá di sostanze presenti nell' ambiente alcune delle quali (composti organici e metalli pesanti) inducono un aumento della produzione di radicali nell'organismo (Winston & Di Giulio, 1991).
L'esposizione ad elevate concentrazioni di queste sostanze pu quindi alterare l'equilibrio tra pressione proossidante e difese antiossidanti inducendo una condizione di stress ossidativo nei mitili.
Generalmente la condizione redox del sistema antiossidante viene valutata attraverso l'analisi dei suoi principali componenti cio specifici enzimi antiossidanti e scavengers a basso peso molecolare (Regoli & Principato, 1995).

Data per l'estrema diversitá di questi ultimi in termini di natura chimica, modo d'azione e localizzazione intracellulare non difficile che una stessa condizione di stress possa determinare l'induzione di un particolare antiossidante e contemporaneamente l'inibizione dell'attivitá di un altro (Regoli & Winston, 1999).
Queste risposte se da una parte evidenziano la presenza di un effetto biologico di determinate sostanze proossidanti, dall' altra possono rendere difficoltoso delineare un quadro complessivo dello stato di salute dell' organismo.
La nuova metodologia analitica da noi sviluppata permette invece una rapida valutazione della capacitá antiossidante totale dell' organismo intesa come protezione fornitagli dall' intero sistema antiossidante nei confronti della tossicitá dei radicali liberi.

Come evidenziato dai nostri risultati il metodo TOSCA permette anche di diversificare in termini quantitativi la resistenza nei confronti di diverse forme di radicali quali il radicale perossilico, il radicale idrossilico e la perossinitrite, tutti ossidanti con diverso potenziale tossico nei confronti delle macromolecole biologiche.
Nel presente lavoro sono stati misurati i valori TOSCA relativi alle ghiandole digestive di due popolazioni naturali di mitili, Mytilus galloprovincialis, raccolte da un sito di controllo, Forte dei Marmi, e da un sito a forte inquinamento da metalli pesanti, Scarlino.
Sono stati analizzati inoltre organismi trapiantati dal sito di controllo al sito inquinato e mantenuti qui per periodi di 1 e 8 settimane.

I risultati mostrano chiaramente una minore capacitá antiossidante da parte dei mitili di Scarlino rispetto a quelli prelevati dal sito di controllo nei confronti di tutte e tre le specie di radicali liberi considerate.

I valori di TOSC dei mitili traslocati ed esposti per un periodo di 8 settimane sono anch'essi molto inferiori rispetto a quelli dei mitili di controllo mentre sono comparabili con quelli misurati nei mitili naturali di Scarlino.
Questi dati dimostrano che alti livelli di contaminanti ambientali possono indurre una riduzione della capacitá del mitilo di contrastare gli effetti tossici dei radicali liberi rendendo l'organismo maggiormente suscettibile alle conseguenze dello stress ossidativo.

Uno dei target cellulari piú suscettibili a danni di tipo ossidativo rappresentato dal comparto lisosomiale (Regoli, 1992).
Qui infatti i radicali liberi possono generarsi sia all'esterno che all'interno della membrana inducendo una rapida destabilizzazione della stessa con perdita di funzionalitá dei lisosomi (Winston et al., 1996).
L' analisi del rosso neutro condotta sui mitili nelle varie condizioni sperimentali ha evidenziato una significativa differenza nella stabilitá delle membrane lisosomiali tra gli organismi di controllo e quelli inquinati e trapiantati, andamento questo che risultato statisticamente correlato con quello della capacitá antiossidante analizzata mediante il saggio TOSCA.

Questo dato evidenzia l'alto valore predittivo del metodo TOSCA su alterazioni di altri livelli o comparti cellulari. Particolarmente importanti risultano le alterazioni a carico dei lisosomi considerando la loro funzione in termini di digestione delle sostanze nutritizie, metabolismo proteico e funzione immunitaria.
Un danno a questo livello avrebbe come conseguenza facilmente prevedibile una diminuzione del potenziale di crescita e riproduttivo del mitilo e quindi una compromissione della resa in termini economici.
Concludendo, possibile affermare che l'estrema rapiditá di esecuzione e la significativitá dei dati ottenibili fanno del TOSCA un valido strumento a supporto della valutazione dello stato di salute di popolazioni di mitili, della loro potenzialitá in termini di resa economica e della loro qualitá e igiene come alimento destinato al consumo.

BIBLIOGRAFIA
Lowe, D.M., Fossato, V.U., Depledge, M.H., 1995. Contaminant-induced lysosomal membrane damage in blood cells of mussel Mytilus galloprovincialis from the Venice Lagoon: an in vitro study. Mar. Ecol. Prog. Ser. 129, 189-196.

Moore, M.N., 1988. Cytochemical responses of the lysosomal system and NADPH-ferrihemoprotein reductase in molluscan digestive cells to environmental and experimental exposures to xenobiotics. Mar. Ecol. Prog. Ser. 46, 81-89.

Regoli, F., 1992. Lysosomal responses as a sensitive stress index in biomonitoring heavy metal pollution. Mar. Ecol. Prog. Ser. 84, 63-89.

Regoli, F., Principato, G., 1995. Glutathione, glutathione-dependent and antioxidant enzymes in mussel, Mytilus galloprovincialis, exposed to metals under field and laboratory conditions: implications for the use of biochemical biomarkers. Aquat. Toxicol. 31, 143-164.

Regoli, F., Winston, G.W., 1999. Quantification of total oxidant scavenging capacity (TOSC) of antioxidant for peroxynitrite, peroxyl radicals and hydroxyl radicals. Toxicol Appl. Pharmacol. 156, 96-105.

Winston, G.W., Di Giulio, R.T., 1991. Prooxidant and antioxidant mechanisms in aquatic organisms. Aquat. Toxicol. 19, 137-161.

Winston, G.W., Moore, M.N., Kirchin, M.A., Soverchia, C., 1996. Production of reactive oxygen species by hemocytes from the marine mussel, Mytilus edulis: lysosomal localization and effect of xenobiotics. Comp. Biochem. Physiol. 113C, 221-229.

Winston, G.W., Regoli, F., Dugas Jr, A.J., Fong, J.H., Blanchard, K.A., 1998. A rapid gas-chromatografic assay for determining oxyradical scavenging capacity of antioxidants and biological fluids. Free Radic. Biol. Med. 24 (3), 480-493.
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