Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 105, Dicembre 2017 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Identificazione in Fast real-time PCR dei principali agenti abortigeni dei ruminanti
Fast Real-Time PCR Identification of the ruminants main abortive agents


Carla Sebastiani1, Ludovica Curcio1, Marcella Ciullo1, Deborah Cruciani2, Silvia Crotti2, Cristina Pesca2, Martina Torricelli1, Martina Sebastianelli1, Andrea Felici3, Massimo Biagetti1



1 R&D, Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Togo Rosati
2 Diagnostic Laboratory, Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Togo Rosati
3 Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Togo Rosati



Abstract. Among ruminants, abortion is the main cause of economic losses. Infectious agents are by far the major risk factors associated with abortion. Pathogen isolation for diagnosis is complicated, time consuming, hazardous and sometimes inconclusive. Diagnosis based on molecular assays can help to easily detect the specific microorganism involved

Riassunto. Tra I ruminanti l'aborto è la causa principale di perdita economica per gli allevatori. Gli agenti infettivi sono le cause principali che causano aborto. L'isolamento diretto dell'agente patogeno è complicato, richiede tempo, e a volte non è conclusivo. La diagnosi molecolare può essere di aiuto a rilevare l'agente patogeno coinvolto



Introduzione
Tra i ruminanti, gli aborti sono la causa principale di perdite economiche per gli allevatori. Sebbene il rischio di aborto dipenda da alcuni fattori, per esempio anormalità genetiche, agenti tossici, stress da calore ecc. gli agenti infettivi sono di gran lunga i principali fattori di rischio associati con gli aborti.
L'importanza di agenti infettivi, quali Brucella spp, Clamydia spp, Coxiella burnetii ed altri è dovuta anche al loro potere zoonotico ovvero sono un costante rischio per la salute umana. Alcuni ceppi di Clamydia e Coxiella burnetii iniziano ad essere responsabili di malattie zoonotiche e aborti anche fra la popolazione umana.
La loro incidenza dipende dalla presenza, dalla distribuzione nell'ambiente e dalle opportunità di contatto. In campo umano la corretta e rapida identificazione del patogeno è molto importante anche perché i vari patogeni hanno una differente sensibilità agli antibiotici; inoltre l'accurata identificazione è anche importante per studi epidemiologici. Nasce quindi l'esigenza di una diagnosi rapida e precisa.
I più comuni agenti infettivi causa di aborto sono Brucella spp., Campylobacter spp., Chlamydia abortus, Coxiella burnetii, Leptospira spp., Neospora caninum, Salmonella spp., Bovine Viral Diarrhea virus, Infectious Bovine Rhinotracheitis virus (Anderson, 2007; Reitt et al., 2007; Clothier and Anderson, 2016; Lucchese et al., 2016; Tramuta et al., 2011) nei bovini, Brucella spp, Chlamydia abortus, Coxiella burnetii, Leptospira spp., Listeria monocytogenes, Mycoplasma spp., Salmonella abortus ovis, Toxoplasma gondii, Border disease virus e Bluetongue virus nei piccoli ruminanti (Menzies, 2011, Hazlett et al, 2013).

Nell'ambito diagnostico la diagnosi diretta, cioè l'isolamento dell'agente patogeno, presenta alcuni fattori limitanti, come lunghi tempi necessari per l'isolamento di molti germi patogeni e per la loro caratterizzazione biochimica che spesso non porta ad un risultato conclusivo; l'isolamento inoltre necessita di laboratori specializzati e personale formato.
La diagnosi indiretta presenta delle difficoltà per le quali non sempre è possibile fare una diagnosi definitiva.

Riassumendo, in campo animale, nella pratica, la diagnosi eziologica incontra una serie di difficoltà, anche perché l'aborto, di norma, non presenta alcun sintomo premonitore. Inoltre, non si osserva nessuna lesione patognomonica e vi è la possibilità di infezioni multiple negli stessi episodi. Altri elementi critici sono la mancanza di un'accurata anamnesi, di un'appropriata raccolta e conservazione dei campioni e di tecniche analitiche accurate. L'impiego dell'amplificazione genica (PCR), ha sicuramente portato ad un abbattimento dei tempi, ma a volte permangono problemi di specificità e sensibilità della reazione. Inoltre in presenza di un aborto è comunque necessario effettuare numerose indagini per poter identificare l'agente causale e pertanto i tempi analitici rimangono comunque abbastanza lunghi.

L'utilizzo della PCR Real Time, per le sue caratteristiche intrinseche di funzionamento, permette di ovviare a questi problemi; infatti questa metodica ha una sensibilità e una specificità maggiore rispetto alla PCR end-point classica, grazie all'utilizzo di sonde a ibridazione altamente specifiche; ha inoltre maggiore affidabilità, ossia una grande ripetibilità dei risultati ottenuti. La PCR Real-time associa amplificazione e rivelazione in un'unica reazione ed, eliminando la necessità di manipolazioni post-PCR, riduce i tempi di analisi ed anche il rischio di contaminazioni Tale metodica rappresenta quindi un valido strumento applicabile per il rilevamento di patogeni in tempi relativamente brevi, circa 1,30 - 2 ore. In questi ultimi anni sono stati ottimizzati dei protocolli "Fast" in PCR Real-time che riducono ulteriormente i tempi di analisi a 30 - 40 minuti.
Nell'ambito della ricerca sono stati scelti gli agenti patogeni che più spesso sono causa di aborti nei ruminanti quali Coxiella burnetii, Chlamydia spp., Brucella spp., Leptospira spp., Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Salmonella spp. con la possibilità di ampliare il pannello in itinere.

Coxiella burnetii
è un batterio Gram negativo intracellulare obbligato, può infettare molte specie diverse di animali, così come gli esseri umani, tra cui i ruminanti che sono considerati i principali serbatoi di infezione umana. L'infezione nei ruminanti rimanere asintomatica ma può causare anoressia e aborto tardivo.
Nei ruminanti domestici le lesioni macroscopiche non sono specifiche, è quindi necessario fare una diagnosi differenziale con altri agenti infettivi e non infettivi. La diagnosi di solito si basa su test sierologici. La presenza di anticorpi indica l'esistenza di una infezione persistente. Diverse tecniche possono essere utilizzate per rilevare C. burnetii come l'isolamento culturale, l'immunoistochimica e la PCR.
L'esame colturale è difficile e non è sempre disponibile in tutti i laboratori come pure l'analisi immunoistochimica. Ad oggi, viene utilizzata sempre più la diagnosi molecolare (Merk Veterinary Manual 2015).

Chlamydia
La Clamidiosi è una delle più importanti cause di problemi riproduttivi di ovini e caprini, soprattutto in allevamenti intensivi. L'aborto è l'espressione clinica più comune dell'infezione che causa importanti perdite economiche e presenta un rischio per la salute umana, in particolare nelle donne in gravidanza.
Né i segni clinici né le lesioni consentono una diagnosi definitiva di clamidiosi. La conferma di infezione si basa sulla rilevazione diretta del batterio utilizzando esami colturali, immunofluorescenza e metodi molecolari. Poiché la maggior parte delle infezioni da Chlamydia non induce significativi cambiamenti nei livelli anticorpali, i test sierologici sono più adatti per studi di prevalenza. La sensibilità e la specificità di questi test sierologici sono molto inferiori rispetto alla rilevazione diretta dell'antigene mediante PCR (Merk Veterinary Manual 2013).

Brucella
La brucellosi è una zoonosi che colpisce una vasta gamma di animali tra cui i ruminanti. Anche se mancano stime accurate sull'incidenza umana, dovuta a casi non segnalati e/o diagnosi errata, la brucellosi è considerata una delle zoonosi batteriche più comuni in tutto il mondo (Musallam et al 2016).
Nelle aree endemiche, la brucellosi è responsabile di importanti perdite economiche per la produzione di bestiame a causa di aborti e ridotta produzione di latte.(Musallam et al 2016).
La malattia si trasmette agli esseri umani attraverso il consumo di latte e prodotti lattiero-caseari non pastorizzati o da animali attraverso il contatto diretto con materiale infetto. La diagnosi si basa su prove batteriologiche e sierologiche. La sieroagglutinazione è il metodo diagnostico standard. capace di rilevare gli anticorpi nel latte, siero di latte e sperma. Un altro test che può essere utilizzato è la fissazione del complemento. Comunque, per la diagnosi di Brucella spp, la coltura è considerata come il metodo standard di riferimento. La PCR fornisce un ulteriore mezzo di rilevamento e identificazione di Brucella spp.

Salmonella
La salmonellosi è una malattia ad eziologia batterica diffusa in tutto il mondo che colpisce numerosi animali, uomo compreso. Nei ruminanti l'infezione si presenta generalmente con forme cliniche sporadiche e raramente con veri e propri focolai. Sono possibili forme abortigene che possono assumere particolare rilevanza economica negli ovini. La diagnosi di solito viene fatta tramite esame colturale e prove biochimiche.
I test sierologici vengono generalmente utilizzati come test di screening; questi sono rapidi ma hanno bassa sensibilità e specificità.
I metodi molecolari, sono i più utilizzati per la ricerca di Salmonella direttamente dal campione clinico.

Leptospira.
La Leptospirosi è una zoonosi ricorrente in tutto il mondo, in particolare nei paesi tropicali. Nel bestiame l'agente è responsabile di problemi riproduttivi, come la sterilità e l'aborto, che può verificarsi in modo asintomatico. La leptospirosi può essere causa indiretta anche di altri problemi nei bovini, come la diminuzione della produzione di latte, l'aumento della suscettibilità a forme di mastite.
La patologia è rara in pecore e capre. Nella maggior parte dei casi gli animali sviluppano una setticemia acuta e vengono trovati morti. L'attuale metodo per la diagnosi di leptospirosi è il test di agglutinazione microscopica (MAT - Microscopic Agglutination Test); determinazione complessa da eseguire ed interpretare, che richiede il mantenimento di colture di leptospira.

Toxoplasma gondii
La toxoplasmosi è la malattia causata dal Toxoplasma gondii, un protozoo parassita intracellulare. Anche se l'ospite definitivo è il gatto, T. gondii può infettare tutti i mammiferi compreso l'uomo ed è una delle cause più importanti di aborto in pecore e capre. Raramente può causare aborto e anche nei bovini. La diagnosi di toxoplasmosi è di solito basata sul rilevamento di alti livelli di anticorpi nel sangue della madre.
Gli anticorpi possono anche essere presenti nei fluidi fetali e possono essere rilevati anche in agnelli neonati prima dell'assunzione del colostro. La positività sierologica della madre non è sufficiente per fare diagnosi in quanto può indicare semplicemente una pregressa infezione. Soprattutto nel settore veterinario viene utilizzata la PCR per rilevare Toxoplasma gondii su campioni clinici provenienti da aborti.

Neospora caninum
Neospora caninum è un parassita che nel 1988 è stato classificato come specie a sè stante; in passato è stato considerato appartenente alla specie di Toxoplasma gondii a causa di analogie strutturali. La Neosporosi è una delle più comuni cause di aborto nei bovini, soprattutto in vacche d'allevamento intensivo. Provoca aborto anche in pecore, capre, bufali d'acqua e camelidi, anche se possono essere meno suscettibili rispetto ai bovini Le principali tecniche utilizzate per la rilevazione di Neospora sono l'immunoistochimica o la PCR.

Obiettivo del progetto è stata la messa a punto di un saggio analitico che permettesse di effettuare una più rapida diagnosi dell'agente causale di un aborto nei ruminanti. A tal fine è stato sviluppato un sistema in Fast Real-Time PCR capace di rilevare un pannello dei principali agenti abortigeni nei ruminanti (Brucella spp, Chlamydia spp, Coxiella burnetii, Leptospira spp, Neospora caninum, Salmonella spp. e Toxoplasma gondii), utilizzando reazioni separate ma simultanee ovvero eseguibili con lo stesso profilo di amplificazione così da evidenziare uno o più agenti infettivi contemporaneamente in un'unica sessione di lavoro.

Materiali e metodi
E' stato condotto uno studio bibliografico e bioinformatico per l'individuazione di primers e sonde specifiche per l'identificazione degli agenti abortigeni presi in esame in grado di permettere l'analisi di più patogeni mediante un unico saggio in PCR Real-time con lo stesso profilo termico e in modalità "Fast".
Per ogni patogeno è stato messo a punto un protocollo di Fast Real-time PCR in duplex, che consente l'amplificazione del DNA del singolo patogeno e di un SPC DNA (Sample Processing Control DNA), un DNA esogeno di controllo amplificato contemporaneamente, utile per il monitoraggio delle fasi di estrazione e di amplificazione.
Campioni di campo provenienti dalla routine diagnostica, sono stati testati sia tramite PCR end-point sia tramite Fast Real-time PCR.

Risultati e Discussione
Il saggio in Fast Real-time PCR, è stato messo a confronto con la PCR end-point, normalmente utilizzata per la diagnostica di routine, considerata come metodo di riferimento. Il saggio in Fast Real-time PCR è risultato avere una ottima sensibilità e specificità analitica.
La sensibilità diagnostica del metodo è risultata del 100% mentre la specificità diagnostica è risultata essere mediamente del 98% (83% per Coxiella e 100% per gli altri agenti). Il nuovo metodo è risultato più sensibile rispetto alla PCR end-point e quindi in grado di rivelare un maggior numero di positivi.

L'analisi in Fast Real-time PCR è più rapida consentendo di raggiungere una diagnosi in circa 2 ore dal prelievo. Inoltre il saggio è in continua evoluzione in quanto è possibile aggiungere ulteriori saggi specifici per altri agenti patogeni a seconda delle richieste diagnostiche.
In conclusione il saggio è sensibile, specifico, rapido e in un'unica sessione di lavoro permette di determinare la presenza di uno o più dei sette agenti abortigeni presi in esame.


Bibliografia


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Musallam I. I., Abo-Shehada M. N., Hegazy J. M. Holt H. R., Guitian F. J., (2016). Systematic review of brucellosis in the Middle East: disease frequency in ruminants and humans and risk factors for human infection. Epidemiology & Infection. 144, 671-685



OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 105/2017 di SPVet.it



Corneli et al, 2017 - Percorso di Certificazione UNI EN ISO 9001: 2015 presso il reparto Produzione terreni colturali dell'Officina Farmaceutica dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Corneli et al, 2017 - Percorso di Certificazione UNI EN ISO 9001: 2015 presso il reparto Produzione terreni colturali dell'Officina Farmaceutica dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche (SPVet.it 105/2017)





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